Trong phương phỏp sắc ký, pha động là cỏc lưu thế (cỏc chất ở trạng thỏi khớ hay lỏng), cũn pha tĩnh cú thể là cỏc chất ở trạng thỏi lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thỏi tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhúm lớn: sắc ký lỏng và sắc ký khớ. Dựa vào cỏch tiến hành sắc ký, người ta chia ra thành cỏc phương phỏp sắc ký chủ yếu sau:
1.4.3.1. Sắc ký cột (C.C).
Đõy là phương phỏp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm cỏc loại silica gel (cú kớch thước hạt khỏc nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột cú thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nú phản ỏnh số đĩa lý thuyết hay khả năng tỏch của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thỡ số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tỏch càng cao và ngược lại. Tuy nhiờn, nếu chất hấp phụ cú kớch thước hạt càng nhỏ thỡ tốc độ chảy càng giảm.
Trong một số trường hợp, nếu lực trọng trường khụng đủ lớn thỡ gõy ra hiện tượng tắc cột (dung mụi khụng chảy được), khi đú người ta phải sử dụng ỏp suất, với ỏp suất trung bỡnh (MPC), ỏp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kớnh (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nú thể hiện khả năng tỏch của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yờu cầu tỏch, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa đường đi của chất cần tỏch so với quóng đường đi của dung mụi là Rf, với mỗi một chất sẽ cú một Rf khỏc nhau. Nhờ vào sự khỏc nhau về Rf này mà ta cú thể tỏch từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yờu cầu tỏch. Nếu tỏch thụ thỡ tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), cũn nếu tỏch tinh thỡ tỷ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tỏch (tức phụ thuộc vào sự khỏc nhau Rf của cỏc chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lờn cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta cú thể đưa chất lờn cột bằng cỏc phương phỏp khỏc nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thụ thỡ phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khụ, tơi hoàn toàn, đưa lờn cột. Nếu tỏch tinh thỡ đưa trực tiếp chất lờn cột bằng cỏch hoà tan chất bằng dung mụi chạy cột với lượng tối thiểu.
Cú hai cỏch đưa chất hấp phụ lờn cột:
- Cỏch 1: Nhồi cột khụ. Theo cỏch này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi cũn khụ, sau đú dựng que mềm để gừ nhẹ lờn thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đú dựng dung mụi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cỏch 2: Nhồi cột ướt. Tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung mụi chạy cột trước với lượng dung mụi tối thiểu. Sau đú đưa dần lờn cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý khụng được để bọt khớ bờn trong (nếu cú bọt khớ gõy nờn hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tỏch) và cột khụng được nứt, góy, dũ.
Tốc độ chảy của dung mụi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tỏch. Nếu tốc độ dũng chảy quỏ lớn sẽ làm giảm tốc độ hiệu quả tỏch. Cũn nếu tốc độ dũng chảy quỏ thấp thỡ sẽ kộo dài thời gian tỏch và ảnh hưởng đến tiến độ cụng việc.
1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử đụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành trờn bản mỏng trỏng sẵn silica gel trờn đế nhụm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM cũn dựng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được trỏng sẵn silica gel dày hơn), cú thể đưa lượng chất nhiều hơn lờn bản và sau khi chạy sắc ký, người ta cú thể cạo riờng phần silica gel cú chứa chất cần tỏch rồi giải hấp phụ bằng dung mụi thớch hợp để thu được từng chất riờng biệt. Cú thể phỏt hiện chất trờn bản mỏng bằng đốn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.