5. Phương pháp nghiên cứu
3.2.3.Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập
Hợp chất A là tinh thể hình kim không màu, điểm nóng chảy 128-129°C. Phổ 13C-NMR, DEPT (Hình 3.3) cho tín hiệu của 11 cacbon trong đó có tín hiều của cabon cacbonyl (C=O) tại 166,84 ppm; 6 tín hiệu của cacbon thơm ở (δC 162,2-113,0 ppm), trong phổ DEPT cho thấy với 6 tín hiệu cacbon thơm này
thì có 3 nhóm metyl (CH3) ở δC (ppm) 137,4 (C-6), 114,7 (C-7), 114,0 (C-5) và 3 cacbon bậc bốn ở độ dịch chuyển trường thấp hơn δC (ppm) 162,16 (C-8), 149,82 (C-8a), 139,4 (C-4a); tín hiệu của 2 cacbon nối đôi (C=C) ở δC 109,4 ppm (C-4), 106,18 ppm (C-3), 2 tín hiệu này là hai tín hiệu cacbon bậc 4; tín hiệu của hai nhóm methyl (CH3) liên kết với cabon của nối đôi ở δC 17,4 ppm (C-9), 12,8 ppm (C-10). Từ dữ liệu của phổ 13C-NMR và DEPT ta có thể khẳng định công thức phân tử của hợp chất A là C11H10O3 và đây là một hợp chất thuộc loại coumarin.
Phổ 1H-NMR (Hình 3.2) của hợp chất A cho thấy tín hiệu proton của một nhóm OH tại δH 11,29 ppm; tín hiệu triplet của một proton metin thuộc vòng thơm ở 7,58 ppm (H-6) với giá trị J= 10,0 Hz; 2 proton metin còn lại của vòng thơm thể hiện tại 6,90 (t, J= 9,5 Hz) (H-5, H-7); 2 tín hiệu singlet xuất hiện ở trường cao là proton của hai nhóm metyl (δH 2,30 ppm; 2,11 ppm).
Bảng 3.2: Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất A STT DEPT δC (ppm) δH (ppm) 1 C=O 166,8 3 C 106,2 4 C 109,4 4a C 139,4 5 CH 113,0 6,90 (1H, t, J=9,5 Hz) 6 CH 137,4 7,58 (1H, t, J=10,0 Hz) 7 CH 114,7 6,90 (1H, t, J=9,5 Hz) 8 C 162,2 8a C 149,8 9 CH3 17,4 2,30 (3H, s) 10 CH3 12,8 2,11 (3H, s)
Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất oospolacton
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất oospolacton
Dựa vào các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT kết hợp so sánh với các tài liệu [74] khẳng định hợp chất A có tên gọi oospolaton (8-hydroxy- 3,4 - dimethyl - 1H -2- benzopyran -2- on hoặc 8 -hydroxy-3,4 - dimethylisocoumarin). Chất này lần đầu tiên được phân lập từ Oospora spp
(1963), Lenzites thermophila, Gloeophyllum abietinum và Gloeophyllum sepiarium. Hợp chất A ngoài khả năng kháng chủng nấm Alternaria, còn thể hiện khả năng làm giảm đau cơ bắp [72].
O O OH CH3 CH3 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10 oospolacton (A) 3.2.3.2. Hợp chất B
Hợp chất B tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 175-176oC. Trên phổ ESI-MS (Hình 3.12) của hợp chất B xuất hiện pic ở m/z 245 [M+Na]+ phù hợp với công thức phân tử C11H10O5Na, công thức phân tử của B là C11H10O5.
Hợp chất B được đo phổ cộng hưởng từ một chiều và hai chiều để xác định cấu trúc của phân tử. Phổ 13C-NMR, DEPT (Hình 3.80) cho tín hiệu của 11 nguyên tử cacbon gồm 6 cacbon thơm (δC 107,6-163,4 ppm), phổ DEPT cho thấy trong 6 cacbon thơm đó có 3 cacbon của nhóm metin (CH) và 3 cacbon bậc bốn; 2 cacbon của một nhóm metin và một nhóm metilen (CH2) liên kết với nhóm hydroxyl (OH) tại δC 70,4 ppm (C-9), 66,6 ppm (C-10); tín hiệu của nhóm cacbonyl (C=O) tại δC 167,3 ppm. Phổ 1H-NMR (Hình 3.78) khẳng định sự có mặt của proton thơm tại δH 7,65 (t, H-6); 7,16 (d, H-7); 6,93 (d, H-5). Ngoài ra còn có tín hiệu singlet của proton của liên kết đôi C=C ở 7,40 ppm (H-3). Từ các dữ liệu phổ trên có thể dự đoán cấu trúc của chất B thuộc loại coumarin.
Cấu trúc của phân tử được khẳng định bằng các tương tác xa giữa C và H trên phổ HMBC (Hình 3.14) (Hình 3.5).
O OH O OH HO 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10
Hình 3.5: Sự tương tác H→C trong phổ HMBC của hợp chất B
Bảng 3.3: Bảng dữ liệu phổ NMR của chất B STT DEPT δC (ppm) δC* (ppm) δH (ppm) δ*H (ppm) [41] 1 C=O 167,9 167,3 2 O 3 CH 144,1 143,5 7,40 (1H, s) 7,51 (1H, s) 4 C 119,9 119,2 4a C 137,5 137,0 5 CH 116,6 116,0 6,93 (1H, d, J=8,4 Hz) 7,01 (1H, d, J= 8,16 Hz) 6 CH 138,6 138,2 7,65 (1H, t, J= 8,4 Hz) 7,76 (1H, dd, J=7,92, 8,16 Hz) 7 CH 114,6 114,4 7,16 (1H, d, J=8,0 Hz) 7,29 (1H, d, J= 7,92 Hz) 8 C 163,4 162,7 8a C 107,6 107,4 9 CH 70,4 69,7 4,85 (1H, m) 4,95 (1H, m) 10 CH2 66,6 66,1 3,77 (Ha, dd, J=11,6, 4,0 Hz) 3,62 (Hb, dd, J=11,6, 6,8 Hz) 3,86 (1H, m) 3,70 (1H, m)
δH (Đo ở 400 MHz trong CDCl3), δH* (Đo ở 400 MHz trong CDCl3)
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất B
Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất B
Hình 3.15. Phổ HMBC của hợp chất B
Từ các dữ liệu phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC kết hợp so sánh với tài liệu [41] khẳng định hợp chất này là oospoglycol hoặc cách gọi khác 4-(1,2-dihydroxyethyl)-8-hydroxy isochromen-1-on. Hợp chất B đã được phân lập từ Oospora spp, Gloeophyllum spp, Lenzites spp, Trametes albida. Hợp chất này có khả năng thể hiện khả năng kháng nấm mạnh và ức chế dopamine β-hydroxylase. O OH O OH HO 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10 H oospoglycol (B) 3.2.3.3. Hợp chất C
Hợp chất C thu được dưới dạng thể hình kim không màu, điểm nóng chảy 176-1780C.
Trên phổ 13C-NMR, DEPT (Hình 3.22) xuất hiện tín hiệu của 28 nguyên tử carbon, trong đó có 6 cacbon methyl, 7 methylen, 11 metin và 4 cacbon bậc bốn được xác định bằng các phổ DEPT 90 và DEPT 135. Hai nối đôi được xác định δC 135,2 (C-6), δC 130,1 (C-7), δC 135,6 (C-22) và δC 131,5 (C-23), hai cacbon bậc ba nối với nguyên tử oxi tại δC 81,4 (C-5) và δC 78,4 (C-8) cùng với hai tín hiệu carbon của nối đôi tại C-6/C-7 rất đặc trưng cho sự tạo thành liên kết peroxit tại C-6; C-7. Ngoài ra cũng trên phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu của một cacbon chứa nhóm hydroxyl tại δ 64,6 (C-3), và sáu nhóm methyl tại δC 12,5 (C-18), δC 17,9 (C-19), δC 20,2 (C-21), δC 19,4 (C-26), δC 19,7 (C-27) và δC 17,2 (C-28).
Phổ 1H-NMR (Hình 3.18), sự có mặt của hai nhóm methyl gắn với cacbon bậc bốn được nhận biết là hai singlet tại δH 0,87 (s, H-18) và 0,95 (s, H-19),
bốn nhóm methyl gắn với cacbon bậc ba tại δH 0,87 (d, J=6,5 Hz, H-26); 0,89 (d, J=6,5 Hz, H-27); 0,96 (d, J=7,0 Hz, H-28) và 1,05 (d, J=6,5 Hz, H-21). Bốn proton của hai nối đôi cũng được xác định tại δH 6,23 (J=8,5 Hz, H-6), 6,44 d
(J=8,5 Hz, H-7), 5,28 (m, H-22) và 5,18 (m, H-23) và một proton oxymethyl tại δ 3,58 (m, H-3).
Các dữ liệu phổ của hợp chất C và so sánh với các dữ liệu phổ tương ứng của ergosterol peroxit [44] và cho kết quả phù hợp. Ngoài ra phổ HSQC (Hình 3.63) và HMBC (Hình 3.23) cũng được thực hiện để xác định chính xác từng giá trị độ dịch chuyển hoá học của cacbon và proton.
Phổ HMBC, tương tác của H-6/C-5, C-10, C-8, tương tác của H-7/C-5, C- 9, tương tác của H-1/ C-1, C-5, C-9, C-10, tương tác của H-18/ C-12, C-13, C- 15, C-17, tương tác của H-21/ C-17, C-20, C-22 cũng như tương tác của H- 28/C-23, C-24, C-25 chứng tỏ sự có mặt của nối đôi tại C-6, C-7 và C-22, C-23 cũng như sự có mặt của liên kết peroxit tại C-5, C-7. Sự trùng khớp về giá trị độ dịch chuyển hoá học của hợp chất C với esgosterol peroxit cũng cho thấy nhóm hydroxy gắn vào C-3 với cấu hình β. Công thức phân tử dự kiến là C28H44O3 với khối lượng phân tử là 428 đvc đã được khẳng định bằng kết quả thu được trên phổ khối lượng EI-MS (Hình 3.16) với sự xuất hiện của các pic ion tại m/z 428 [M]+. Bảng 3.4: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất C STT DEPT δC (ppm) δC* (ppm) [44] 1 CH2 34,5 35,1 2 CH2 29,9 30,5 3 CH 64,6 66,8 4 CH2 38,7 37,3 5 C 81,4 83,1 6 CH 135,2 135,8 7 CH 130,1 131,1 8 C 78,4 79,8 9 CH 50,9 51,4 10 C 36,9 37,3 11 CH2 21,7 23,8 12 CH2 39,7 39,7
13 C 44,0 44,9 14 CH 51,2 52,0 15 CH2 22,8 21,0 16 CH2 28,2 29,0 17 CH 55,4 56,5 18 CH3 12,5 13,3 19 CH3 17,9 18,6 20 CH 40,1 40,1 21 CH3 20,2 21,3 22 CH 135,6 135,6 23 CH 131,5 132,4 24 CH 42,0 43,1 25 CH 32,4 33,4 26 CH3 19,4 20,0 27 CH3 19,7 20,3 28 CH3 17,2 17,9
δC (Đo ở 125 MHz trong CD3OD), δH* (Đo ở 100 MHz trong CD3OD)
Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của hợp chất C
Hình 3.19. Phổ 13C-NMR của hợp chất C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.21. Phổ DEPT của hợp chất C
Từ dữ liệu trên, hợp chất C được xác định là ergosterol peroxit (5α, 8α- epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol). Hợp chất này có khả năng ức chế thuốc bổ sung mạnh hơn ergosterol [44].
HO CH3 CH3 CH3 CH3 H3C CH3 H 1 2 3 4 5 6 7 8 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 O O 9 10 ergosterol peroxit (C)
KẾT LUẬN
Nghiên cứu thành phần hóa học nấm vân chi (Trametes cubensis) ở Nghệ An chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:
- Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) (6,4 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi methanol (10L x 3) ở nhiệt độ phòng, thu được dich chiết được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao metanol thô màu nâu (580g). Bằng các phương pháp phân bố cao metanol trong nước và chiết với các dung môi chọn lọc sau đó cất quay chân không thu được 380 g cao etyl axetat và 80g cao n-hexan. Phân lập các hợp chất từ cao etyl axetat bằng các phương pháp sắc ký thu được hợp chất A (7mg), hợp chất B (57mg) và hợp chất C (34mg).
- Đã tiến hành sử dụng các phương pháp phổ hiện đại: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY) để xác định cấu trúc hợp chất tách được. Các kết quả phổ đã cho phép khẳng định chất A được đặt tên là oospolacton, chất B có tên là oospoglycol và hợp chất C là ergosterol
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
1. Nguyễn Thị Ngần, Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Thị Yên, Trần Đình Thắng, (2015), Thành phần hóa học của quả nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) ở Việt Nam. Tạp chí khoa học – Đại học Vinh, T.44, S.2A, 70-73.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1 Ngô Anh (2003), Nghiên cứu thành phần loài nấm lớn ở Thừa Thiên Huế, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
2 Lê Bá Dũng (2003), Nấm lớn Tây Nguyên,Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
3 Trần Thị Lệ Hằng, Trịnh Tam Kiệt (2008), Định loại các loài nấm lớn ở Thành phố Vinh và thị xã Cửa Lò, Nghệ An, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, 4, tr. 43-46.
4 Trịnh Tam Kiệt (1978), Đặc điểm khu hệ nấm lớn sống trên gỗ và tre của Việt Nam, Tạp chí Lâm nghiệp, 10, tr. 20-25.
5 Trịnh Tam Kiệt, Trịnh Tam Bảo (2008), Thành phần loài nấm dược liệu của Việt Nam, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ Sinh học, 4, tr. 39-42.
6 Trịnh Tam Kiệt (2012), Nấm lớn ở Việt Nam, Tập 1, 2. Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
7 Trương Bích Ngân, Phạm Văn Cường, Doel D. Soejarto, Đoàn Thị Mai Hương, Nguyễn Văn Hùng (2009), Nghiên cứu thành phần hóa học cây mộc hương lá dài (Xylosma longifolium Clos), Tạp chí Hoá học, 47(4A) tr. 405-408.
8 Lê Xuân Thám (2005), Nấm Linh chi Ganodermataceae tài nguyên dược liệu quý ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
9 Nguyễn Nghĩa Thìn, Mai Văn Phô (2003), Đa dạng sinh học hệ nấm và thực vật Vườn Quốc gia Bạch Mã, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
Tiếng Anh
10 Abate D., Abraham W. R. (1994), Antimicrobial metabolites from Lentinus crinitus, J. Antibiot., 47, pp. 1348-1350.
11 Adam H. K., Bryce T. A., Campbell I. M., McCorkindale N. J. (1967), Metabolites of the Polyporaceae II. Carboxyacetylquercinic acid - a novel triterpene conjugate from Daedalea quercina, Tetrahedron Letter, 16, pp. 1461- 1465.
12 Anke T., Giannetti B. M., Steglich W. Z. (1982), Antibiotics from basidiomycetes XV. 1-Hydroxy-2-nonyn-4-one, an antifungal and cytotoxic metabolite from Ischnoderma benzoinum (Wahl.), Z. Naturforsch, 37C, pp. 1-4. 13 Anne C. K., Marc P. M., Kurt H. (1996), Antimicrobial steroids from the
fungus Fomitopsis pinicola, Phytochemistry, 41(4), pp. 1041-1046.
Takeuchi T. (1990), Production, isolation and structure determination of a novel beta-glucosidase inhibitor, cyclophellitol from Phellinus sp., J. Antibiot., 43, pp. 49-53.
15 Berdy J. (2005), Bioactive microbial metabolites: a personal view, J. Antibiot.,
58, pp. 1-26.
16 Brandt C. R., Piraino F. (2000), Mushroom antivirals, Rec. Res. Dev. Antimicrob. Agents Chemother., 4, pp. 11-26.
17 Caroline G., Emmanuelle R. L., Adriana C. C., Paul H. N. (2002), Immunoblotting and sequential lysis protocols for the analysis of tyrosine phosphorylation- dependent signaling, J. Immunol. Methods, 271(1-2) pp. 185-201.
18 Chen C. H., Yang S. W., Shen Y. C. (1995), New steroidal acids from Antrodia cinnamomea-A fungus parasite of Cinnamomum micranthum, J. Nat. Prod., 58 (11) pp. 1655-1661. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
19 Chiang Y.M., Liu H.K., Lo J.M., Chien S.C., Chan Y.F., Lee T.H., Su J.K., Kuo Y.H. (2003), Cytotoxic constituents of the leaves of Calocedrus formosana, J. Chin. Chem. Soc., 50, pp. 161-166.
20 Clough J. M. (1993),Basidiomycetes as a source for new bioactive natural products, Nat. Prod. Rep., 10, pp. 565-574.
21 Colins R. A., Ng T. B. (1997), Polysaccharopeptide from Coriolus versicolor
has potential for use against human immunodeficiency virus type 1 infection,
Life Sci., 60, pp. 383-387.
22 Dejong E., Field J., Spinnier H. E., Wijnberg J. B. P. A., Bebont J. A. M. (1994), Significant biogenesis of chlorinated aromatics by fungi in natural environments, Appl. Environ. Microbiol., 60, pp. 264-270.
23 EI-Mekkawy S., Meselhy M. R., Nakamura N., Tezuka Y., Hattori M., Kakiuchi N., Shimotohno K., Kawahata T., Otake T. (1998), Anti-HIV-1 and anti-HIV-1- protease substances from Ganoderma lucidum, Phytochemistry, 49, pp. 1651- 1657.
24 Eo S. K., Kim Y. S., Oh K. W., Lee C. K., Lee Y. N., Han S. S. (2001), Mode of antiviral activity of water soluble components isolated from Elfvingia applanat on vesicular stomatitis virus, Arch. Pharm. Res., 24, pp. 74-78.
25 Erkel G., Anke T., Sterner O. (1996), Inhibitionof NF-κB activation by panepoxydone, Biochem. Biophys. Res. Commun., 226, pp. 214-221.
26 Francisco L., Jose Q., Augusto R., Francisco E., Jaime B. (2004), Lanostanoid triterpenes from Laetiporus sulphureus and apoptosis induction on HL-60 human myeloid leukemia cells, J. Nat. Prod., 67, pp. 2008-2011.
27 Gao J. J., Min B. S., Ahn E. M., Nakamura N., Lee H. K., Hattori M. (2002), New triterpene aldehides, lucialdehides A- C, from Ganoderma lucidum and their cytoxicity against murine and human tumor cells, Chem. Pharm. Bull., 50, pp. 837-840.
28 Giannetti B. M., Steglich W., Quack W., Anke T., Oberwinkler F. (1978), Antibiotika as Basidiomyceten, IV. Merulinsauren A, B and C, neue antibiotika aus Merulius tremellosus Fr. und Phlebia radiate Fr., Z. Naturforsch. 33C, pp. 807-816.
29 Hansen M. B., Nielsen S. E., Berg K. (1989), Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell-growth cell kill, J. Immunol. Methods, 119, pp. 203-210.
30 Hashimoto T., Asakawa Y. (1998), Biologically active substances of Japanese in-edible mushrooms, Heterocycles, 47, pp. 1067-1110.
31 Hawksworth D. L. (2001), The magnitude of fungal diversity: the 1.5 milion species estimate revisited, Mycol. Res., 105, pp. 1422-1432.
32 Hawksworth D. L. (2004), Fungal diversity and its implication for genetic resource collections, Stud. Mycol., 50, pp. 9-18.
33 Hirose K., Hakozaki M., Kakuchi J., Matsunaga K., Yoshikumi C., Takahashi M., Tochikura T. S., Yamamoto N. (1987), A biological response modifier, PSK, inhibits reverse transcriptase in vitro, Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, pp. 562-567.
34 Hirotani M., O’Reilly J., Donnelly D. M. X., Polonsky J. (1977), Fomannoxin- A toxic metabolite of Fomes annosus, Tetrahedron Lett., 18(7) pp. 651-652. 35 Hussain M. M., Rahman M. S., Jabbar A., Rashid M. A. (2008), Phytochemical
and biological investigations of Albizzia lebbeck Benth, Bol. Latinoam. Caribe Plant. Med. Aromaticas, 7 (5) pp. 273-278.
36 Hwang T. L., Wang C. C., Kuo Y. H., Huang H. C., Wu Y. C., Kuo L. M., Wu Y. H. (2010), The hederagenin saponin SMG-1 is a natural FMLP receptor inhibitor that suppresses human neutrophil activation, Biochem. Pharm., 80(8) pp. 1190-1200.
37 Ichimura T., Watanabe O., Maruyama S. (1998), Inhibition of HIV-1 protease by water-soluble lignin-like substance from an edible mushroom Fuscoporia