5. Phương pháp nghiên cứu
2.1.3.Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:
- Phổ tử ngoại (UV); - Phổ hồng ngoại (IR);
- Phổ khối lượng (EI-MS), (ESI-MS), (HR-ESI-MS); - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR;
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR;
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC;
- Cấu trúc lập thể tương của các hợp chất này được xác định các phương pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY.
2.2. Hóa chất và thiết bị 2.2.1. Hoá chất
Các dung môi để ngâm chiết mẫu nấm đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA).
2.2.2. Thiết bị
2.2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng phân tích được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 105715), độ dày 0,2 mm; RP18 F254s (Merck).
Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm; dùng hơi Iot (I2) hiện màu những chất có trên bản mỏng hoặc dùng dung dịch axit sunfuric đặc (H2SO4) phun lên bản mỏng rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu.
Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck), độ dày 0,5-1 mm.
Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm; hơi Iot (I2) hiện màu.
2.2.2.2. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được thực hiện với chất hấp thụ silica gel pha thường, pha đảo có cỡ hạt 70-230 nm/mesh; 230-400 nm/mesh (Merck).
2.2.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao được tiến hành trên hệ thống Shimadzu LC-8A và được trang bị hệ thống -10A VP kết hợp với phần mềm CLASS-VP (Shimadzu Co., Ltd) Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan; cột tách Inertsil ODS-3 5µm 150x 4,6 mm I.D; 5-C18-MS-II.
2.2.2.4. Phổ tử ngoại (UV)
Phổ tử ngoại được ghi trên máy Agilent UV-VIS thuộc Đại học Quốc gia Cheng-Kung, Đài Loan.
2.2.2.5. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Shimadzu FTIR Prestiga-21 tại khoa Hoá, Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan.
2.2.2.6. Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối lượng (ESI-MS) được đo trên máy Bruker Dailtonics APEX II 30eV spectrometer của khoa Dược, Trường Đại học Y, Đài Loan và máy micrOTOF-QII 10187 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh.
Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) được ghi trong các dung môi thích hợp trên máy micrOTOF-QII 10187 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thành phố Hồ Chí Minh và máy Bruker Dailtonics APEX II 30eV spectrometer của khoa Dược, Trường Đại học Y Trung Quốc, Đài Loan.
2.2.2.7. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR đo trên máy Bruker 500MHz, phổ
13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY và NOESY đo trên máy Bruker 125 MHz (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) và máy Bruker AVANCE-500 và AVANCE III-400 (Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan) với chất chuẩn là TMS.
2.2.2.8. Điểm nóng chảy
Điểm nóng chảy được đo trên máy Yanagimoto MP-S3 tại Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan.
2.2.2.9. Độ quay cực riêng
Góc quay cực quan sát được (α) đo trên máy Jasco P-1020 (Nhật) tại Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan. Đo độ quay cực riêng tính theo công thức :
[ ] d l o t × = α α λ
2.3. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis).2.3.1. Mẫu nấm. 2.3.1. Mẫu nấm.
Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) được thu hái vào tháng 08/2012 ở huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An. Mẫu được định danh bởi PGS. TS. Ngô Anh (khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế). Tiêu bản (ký hiệu Vinh- TSWu 201208) được lưu giữ tại khoa Hoá học, Trường Đại học Vinh.
Trong đó: α: góc quay cực riêng l : bề dày dung dịch mẫu đo
2.3.2. Phân lập các chất
Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) (6,4 kg) được thu hái, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 40-50oC trong 48 giờ, toàn bộ mẫu nấm vân chi được ngâm chiết bằng dung môi metanol trong 14 ngày. Dịch lọc thu được sau khi ngâm chiết được cất thu hồi dung môi thu được cao tổng metanol (580 g).
Cao metanol được chiết lần lượt với dung môi hexan và etyl axetat (EtOAc), rồi cất thu hồi dung môi được cao chiết DQH (80 g) và DQE (380 g) (Sơ đồ 2.1).
Lấy 200 g cao DQE được tiến hành sắc ký cột silica gel (kích thước hạt 70-230 nm/mesh, dcột x Lcột = 20x160 cm), với hệ dung môi rửa giải CHCl3:CH3OH (20:1,15:1, 10:1, 6:1, 4:1, 2:1, 0:1) thu được 10 phân đoạn (Sơ đồ 2.2).
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis)
Phân đoạn 3 tiến hành sắc ký cột (dcột x Lcột= 10x72 cm) silica gel 230-400 nm, dung môi rửa giải CHCl3: CH3OH (25:1) thu được 3 phân đoạn. Phân đoạn
3-1 (2,80 g) tiếp tục tiến hành sắc ký cột (dcột x Lcột= 10x 50cm) silica gel 70-230 nm, vẫn chạy dung môi CHCl3: MeOH (25:1) thu được chất sạch B (57 mg).
1.Chiết với dung môi MeOH 2. Cất giảm áp loại dung môi
1. Phân bố trong H2O.
2.Chiết lần lượt với hexan, EtOAc. 3. Cất giảm áp loại dung môi. Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis)
(6,4 kg)
Cao MeOH (580 g)
Phân đoạn 3-2 (5,42 g) được tách trên cột (dcộtx Lcột = 5x40 cm) silica gel 230- 400 nm/mesh, dung môi rửa giải CHCl3:MeOH (30:1 thu được chất sạch C (34 mg).
Phân đoạn 4 (10,40 g) chạy grad với hệ dung môi rửa giải là CHCl3/CH3OH 25:1; 15:1; 9:1; 6:1; 4:1; 2:1. Thu được 4 phân đoạn, lấy phân đoạn 4-2 (3,54 g) chạy sắc ký cột trên cột (dcộtx Lcột = 3x50 cm) silicagel 230-400 nm/mesh, dung môi rửa giải hexan: axeton (10:1) thu được chất sạch A (7 mg) .
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chấtA, B, C.
F1 Cao etylaxetat 200g F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F3-1 F3-2 F3-3 F4-1 F4-2 F4-3 F4-4 Chất B 57 mg Chất C 34 mg Chất A 7 mg CC, SiO2, grad CHCl3/CH3OH 100:0; 50:1; 25:1; 15:1; 9:1; 4:1; 2:1 CC, SiO2 CHCl3: CH3OH 25: 1 CC, SiO2, grad CHCl3/CH3OH 25:1; 15:1; 9:1; 6:1; 4:1; 2:1
2.3.3. Hằng số vật lý của các hợp chất 2.3.3.1. Hợp chất A O O OH CH3 CH3 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10
Hợp chất A là tinh thể màu trắng; đ.n.c 128-129°C. Phổ UV (EtOH) λmax
nm: 230, 237, 260, 342.
Phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS) cho pic ion phân tử m/z: 190
[ ]M+ tương ứng với công thức phân tử C11H10O3.
Phổ 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) (δ ppm) cho thấy tín hiệu của 2 nhóm metyl: δ 2,30 (3H, s, H-9); δ 2,11 (3H, s, H-10); và các tín hiệu của proton ở δ 7,58 (1H, t, J=10,0 Hz, H-6); δ 6,90 (1H, t, J=9,5 Hz, H-5, 7).
Phổ 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) (δ ppm) cho thấy tín hiệu 11 nguyên tử cacbon trong đó có tín hiệu của cacbon cacbonyl (C=O) tại 166,8 (C-1); 6 tín hiệu cacbon thơm ở: 162,2 (C-8); 149,8 (C-8a); 139,4 (C-4a); 137,4 (C-6); 114,7 (C-7); 113,0 (C-5); 109,4 (C-4); 106,2 (C-3); 17,4 (C-9); 12,8 (C-10). 2.3.3.2. Hợp chất B O OH O OH HO 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10 H Tinh thể màu trắng; đ.n.c 175-176°C
ESI-MS m/z: 245 [M+Na]+; phù hợp với công thức phân tử C11H10O5.
Phổ 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) (δ ppm): 7,65 (1H, t, J= 8,4 Hz, H-6); 7,40 (1H, s, H-3); 7,15 (1H, d, J=8,0 Hz, H-7); 6,93 (1H, d, J=8,4 Hz, H-5); 4,85
(1H, m, H-9); 3,77 (1H, dd, J=11,6, 4,0 Hz, H-10α); 3,62 (1H, dd, J=11,6, 6,8 Hz, H-10β). 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) (δ ppm): 167,9 (C-1); 163,4 (C-8); 144,1 (C- 3); 138,6 (C-6); 137,5 (C-4ª); 119,9 (C-4); 116,6 (C-5); 114,6 (C-7); 107,6 (C- 8ª); 70,4 (C-9); 66,6 (C-10). 2.3.3.3. Hợp chất C HO CH3 CH3 CH3 CH3 H3C CH3 H 1 2 3 4 5 6 7 8 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 O O 9 10
Tinh thể hình kim không màu, đ.n.c: 176-1780C. EI-MS m/z 428 [M]+. 1H-NMR (500MHz, CDCl3) (δ ppm): 6,44 d (J=8,5 Hz, H-7); 6,23 (J=8,5 Hz, H-6); 5,28 (m, H-22); 5,18 (m, H-23); 3,58 (m, H-3); 1,05 (d, J=6,5 Hz, H- 21); 0,96 (d, J=7,0 Hz, H-28); 0,95 (s, H-19); 0,89 (d, J=6,5 Hz, H-27); 0,87 (s, H-18); 0,87 (d, J=6,5 Hz, H-26). 13C-NMR (125MHz, CDCl3) (δ ppm): 135,6 (C-22); 135,2 (C-6); 131,5 (C- 23); 130,1 (C-7); 81,4 (C-5); 78,4 (C-8); 64,6 (C-3); 55,4 (C-17); 51,2 (C-14); 50,9 (C-9); 44,0 (C-13); 42,0 (C-24); 40,1 (C-20); 38,7 (C-4); 36,9 (C-10); 36,5 (C-12); 34,5 (C-2); 32,4 (C-25); 29,9 (C-1); 28,2 (C-16); 22,8 (C-15); 21,7 (C- 11); 20,2 (C-21); 19,7 (C-27); 19,4 (C-26); 17,9 (C-19); 17,2 (C-28); 12,5 (C- 18).
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập các hợp chất
Từ dịch chiết metanol của quả thể nấm vân chi, bằng các phương pháp sắc ký cột trên silica gel đã phân lập được hợp chất A, B và C.
Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ.
3.2. Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis)3.2.1. Mẫu nấm 3.2.1. Mẫu nấm
Mẫu nghiên cứu nấm vân chi (Trametes cubensis) được thu hái ở Kỳ Sơn, Nghệ An vào tháng 08/2012. Mẫu được định danh bởi PGS. TS Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học Huế. Tiêu bản được lưu giữ tại khoa Hoá, Trường Đại học Vinh.
3.2.2. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm vân chi
Quá trình phân lập các chất từ quả thể nấm vân chi đã được trình bày cụ thể ở phần thực nghiệm. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã tập trung nghiên cứu thành phần hoá học từ dịch chiết etylaxetat của quả thể nấm vân chi bằng cách kết hợp các phương pháp chiết, sắc ký bản mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các hệ dung môi rửa giải phù hợp với từng phân đoạn. Kết quả của quá trình phân lập thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Các hợp chất phân lập từ quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis)
STT Ký hiệu Tên hợp chất Công thức
phân tử Khối lượng hợp chất (mg) 1 A Oospolacton C11H10O3 7 2 B Oospoglycol C11H10O5 57 3 C Ergosterol peroxit C24H44O3 34
3.2.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập 3.2.3.1. Hợp chất A 3.2.3.1. Hợp chất A
Hợp chất A là tinh thể hình kim không màu, điểm nóng chảy 128-129°C. Phổ 13C-NMR, DEPT (Hình 3.3) cho tín hiệu của 11 cacbon trong đó có tín hiều của cabon cacbonyl (C=O) tại 166,84 ppm; 6 tín hiệu của cacbon thơm ở (δC 162,2-113,0 ppm), trong phổ DEPT cho thấy với 6 tín hiệu cacbon thơm này
thì có 3 nhóm metyl (CH3) ở δC (ppm) 137,4 (C-6), 114,7 (C-7), 114,0 (C-5) và 3 cacbon bậc bốn ở độ dịch chuyển trường thấp hơn δC (ppm) 162,16 (C-8), 149,82 (C-8a), 139,4 (C-4a); tín hiệu của 2 cacbon nối đôi (C=C) ở δC 109,4 ppm (C-4), 106,18 ppm (C-3), 2 tín hiệu này là hai tín hiệu cacbon bậc 4; tín hiệu của hai nhóm methyl (CH3) liên kết với cabon của nối đôi ở δC 17,4 ppm (C-9), 12,8 ppm (C-10). Từ dữ liệu của phổ 13C-NMR và DEPT ta có thể khẳng định công thức phân tử của hợp chất A là C11H10O3 và đây là một hợp chất thuộc loại coumarin.
Phổ 1H-NMR (Hình 3.2) của hợp chất A cho thấy tín hiệu proton của một nhóm OH tại δH 11,29 ppm; tín hiệu triplet của một proton metin thuộc vòng thơm ở 7,58 ppm (H-6) với giá trị J= 10,0 Hz; 2 proton metin còn lại của vòng thơm thể hiện tại 6,90 (t, J= 9,5 Hz) (H-5, H-7); 2 tín hiệu singlet xuất hiện ở trường cao là proton của hai nhóm metyl (δH 2,30 ppm; 2,11 ppm).
Bảng 3.2: Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất A STT DEPT δC (ppm) δH (ppm) 1 C=O 166,8 3 C 106,2 4 C 109,4 4a C 139,4 5 CH 113,0 6,90 (1H, t, J=9,5 Hz) 6 CH 137,4 7,58 (1H, t, J=10,0 Hz) 7 CH 114,7 6,90 (1H, t, J=9,5 Hz) 8 C 162,2 8a C 149,8 9 CH3 17,4 2,30 (3H, s) 10 CH3 12,8 2,11 (3H, s)
Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất oospolacton
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất oospolacton
Dựa vào các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT kết hợp so sánh với các tài liệu [74] khẳng định hợp chất A có tên gọi oospolaton (8-hydroxy- 3,4 - dimethyl - 1H -2- benzopyran -2- on hoặc 8 -hydroxy-3,4 - dimethylisocoumarin). Chất này lần đầu tiên được phân lập từ Oospora spp
(1963), Lenzites thermophila, Gloeophyllum abietinum và Gloeophyllum sepiarium. Hợp chất A ngoài khả năng kháng chủng nấm Alternaria, còn thể hiện khả năng làm giảm đau cơ bắp [72].
O O OH CH3 CH3 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10 oospolacton (A) 3.2.3.2. Hợp chất B
Hợp chất B tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 175-176oC. Trên phổ ESI-MS (Hình 3.12) của hợp chất B xuất hiện pic ở m/z 245 [M+Na]+ phù hợp với công thức phân tử C11H10O5Na, công thức phân tử của B là C11H10O5.
Hợp chất B được đo phổ cộng hưởng từ một chiều và hai chiều để xác định cấu trúc của phân tử. Phổ 13C-NMR, DEPT (Hình 3.80) cho tín hiệu của 11 nguyên tử cacbon gồm 6 cacbon thơm (δC 107,6-163,4 ppm), phổ DEPT cho thấy trong 6 cacbon thơm đó có 3 cacbon của nhóm metin (CH) và 3 cacbon bậc bốn; 2 cacbon của một nhóm metin và một nhóm metilen (CH2) liên kết với nhóm hydroxyl (OH) tại δC 70,4 ppm (C-9), 66,6 ppm (C-10); tín hiệu của nhóm cacbonyl (C=O) tại δC 167,3 ppm. Phổ 1H-NMR (Hình 3.78) khẳng định sự có mặt của proton thơm tại δH 7,65 (t, H-6); 7,16 (d, H-7); 6,93 (d, H-5). Ngoài ra còn có tín hiệu singlet của proton của liên kết đôi C=C ở 7,40 ppm (H-3). Từ các dữ liệu phổ trên có thể dự đoán cấu trúc của chất B thuộc loại coumarin.
Cấu trúc của phân tử được khẳng định bằng các tương tác xa giữa C và H trên phổ HMBC (Hình 3.14) (Hình 3.5).
O OH O OH HO 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10
Hình 3.5: Sự tương tác H→C trong phổ HMBC của hợp chất B
Bảng 3.3: Bảng dữ liệu phổ NMR của chất B STT DEPT δC (ppm) δC* (ppm) δH (ppm) δ*H (ppm) [41] 1 C=O 167,9 167,3 2 O 3 CH 144,1 143,5 7,40 (1H, s) 7,51 (1H, s) 4 C 119,9 119,2 4a C 137,5 137,0 5 CH 116,6 116,0 6,93 (1H, d, J=8,4 Hz) 7,01 (1H, d, J= 8,16 Hz) 6 CH 138,6 138,2 7,65 (1H, t, J= 8,4 Hz) 7,76 (1H, dd, J=7,92, 8,16 Hz) 7 CH 114,6 114,4 7,16 (1H, d, J=8,0 Hz) 7,29 (1H, d, J= 7,92 Hz) 8 C 163,4 162,7 8a C 107,6 107,4 9 CH 70,4 69,7 4,85 (1H, m) 4,95 (1H, m) 10 CH2 66,6 66,1 3,77 (Ha, dd, J=11,6, 4,0 Hz) 3,62 (Hb, dd, J=11,6, 6,8 Hz) 3,86 (1H, m) 3,70 (1H, m)
δH (Đo ở 400 MHz trong CDCl3), δH* (Đo ở 400 MHz trong CDCl3)
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất B
Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất B
Hình 3.15. Phổ HMBC của hợp chất B
Từ các dữ liệu phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC kết hợp so sánh với tài liệu [41] khẳng định hợp chất này là oospoglycol hoặc cách gọi khác 4-(1,2-dihydroxyethyl)-8-hydroxy isochromen-1-on. Hợp chất B đã được phân lập từ Oospora spp, Gloeophyllum spp, Lenzites spp, Trametes albida. Hợp chất này có khả năng thể hiện khả năng kháng nấm mạnh và ức chế dopamine β-hydroxylase. O OH O OH HO 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10 H oospoglycol (B) 3.2.3.3. Hợp chất C
Hợp chất C thu được dưới dạng thể hình kim không màu, điểm nóng chảy 176-1780C.
Trên phổ 13C-NMR, DEPT (Hình 3.22) xuất hiện tín hiệu của 28 nguyên tử carbon, trong đó có 6 cacbon methyl, 7 methylen, 11 metin và 4 cacbon bậc bốn được xác định bằng các phổ DEPT 90 và DEPT 135. Hai nối đôi được xác định δC 135,2 (C-6), δC 130,1 (C-7), δC 135,6 (C-22) và δC 131,5 (C-23), hai cacbon bậc ba nối với nguyên tử oxi tại δC 81,4 (C-5) và δC 78,4 (C-8) cùng với hai tín hiệu carbon của nối đôi tại C-6/C-7 rất đặc trưng cho sự tạo thành liên kết peroxit tại C-6; C-7. Ngoài ra cũng trên phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu của một cacbon chứa nhóm hydroxyl tại δ 64,6 (C-3), và sáu nhóm methyl tại δC 12,5 (C-18), δC 17,9 (C-19), δC 20,2 (C-21), δC 19,4 (C-26), δC 19,7 (C-27) và δC 17,2 (C-28).
Phổ 1H-NMR (Hình 3.18), sự có mặt của hai nhóm methyl gắn với cacbon bậc bốn được nhận biết là hai singlet tại δH 0,87 (s, H-18) và 0,95 (s, H-19),
bốn nhóm methyl gắn với cacbon bậc ba tại δH 0,87 (d, J=6,5 Hz, H-26); 0,89 (d, J=6,5 Hz, H-27); 0,96 (d, J=7,0 Hz, H-28) và 1,05 (d, J=6,5 Hz, H-21). Bốn proton của hai nối đôi cũng được xác định tại δH 6,23 (J=8,5 Hz, H-6), 6,44 d
(J=8,5 Hz, H-7), 5,28 (m, H-22) và 5,18 (m, H-23) và một proton oxymethyl tại δ 3,58 (m, H-3).
Các dữ liệu phổ của hợp chất C và so sánh với các dữ liệu phổ tương ứng của ergosterol peroxit [44] và cho kết quả phù hợp. Ngoài ra phổ HSQC (Hình 3.63) và HMBC (Hình 3.23) cũng được thực hiện để xác định chính xác từng giá trị độ dịch chuyển hoá học của cacbon và proton.
Phổ HMBC, tương tác của H-6/C-5, C-10, C-8, tương tác của H-7/C-5, C- 9, tương tác của H-1/ C-1, C-5, C-9, C-10, tương tác của H-18/ C-12, C-13, C- 15, C-17, tương tác của H-21/ C-17, C-20, C-22 cũng như tương tác của H- 28/C-23, C-24, C-25 chứng tỏ sự có mặt của nối đôi tại C-6, C-7 và C-22, C-23 cũng như sự có mặt của liên kết peroxit tại C-5, C-7. Sự trùng khớp về giá trị độ dịch chuyển hoá học của hợp chất C với esgosterol peroxit cũng cho thấy nhóm hydroxy gắn vào C-3 với cấu hình β. Công thức phân tử dự kiến là C28H44O3 với khối lượng phân tử là 428 đvc đã được khẳng định bằng kết quả thu được trên phổ khối lượng EI-MS (Hình 3.16) với sự xuất hiện của các pic ion tại m/z 428 [M]+. Bảng 3.4: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất C STT DEPT δC (ppm) δC* (ppm) [44] 1 CH2 34,5 35,1 2 CH2 29,9 30,5