- Nghiên cứu tổng hợp thuốc chữa bệnh tiểu đường metformin hydrochloride.
- Ngiên cứu kết tinh m etform in hydrochloride trong các dung môi khác nhau.
- Đưa ra quy trình tông hợp với hiệu suất tối ưu.
- Nghiên cứu xác định cấu trúc các hợp chất tổng hợp được bằng phương pháp hóa lý hiện đại như phố cộng hưởng từ hạt nhân ('H-NM R).
- Xác định độc tính cap LD50 của thuốc chữa bệnh tiểu đường metformin hydrochloride
2.2. Phưong pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị Phương pháp nghiên CÚ01
Thực hiện các phương pháp tống họp hữu cơ như: phản ứng bảo vệ nhóm chức, phản ứng thủy phân, phản ứng khử, phản ứng thế, phản ứng cộng... tại Phòng thí nghiệm Hoá Dược-Viện Hoá học-Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, nhằm tồng họp một số các dẫn xuất của diketopiperazine.
Cấu trúc của sản phẩm được xác định nhờ các phương pháp phồ vật lý hiện đại như 1H-NMR.
Độ sạch của sản phấm xác định nhò’ các phương pháp sắc kí như TLC, HPLC, GC-MS, LC-MS.
Hóa chất và dung môi.
Các hoá chất dùng cho tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và thuộc loại phân tích dùng cho phân tích.
Bột silica gel cho sắc ký cột 100 - 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel đế nhôm Art. 5554 DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck).
Thiết bị và dụng cụ
Bảng l ĩ Các thiết bị chính sử dụng trong phòng th í nghiệm
STT Tên Thiêt Bị Mục đích sử dụng Hãng sản xuât
1 Cân điện tử Cân chính xác lượng mâu, bao bì Deshi-Nhật Bản
2 Máy sây/ Tủ sây Làm khô, cô khô Merck- Đức
3 Máy khuây từ/ Cung câp nhiệt, điêu khiên tôc độ Magnetic Strirrer
khuấy cơ khuấy - China
4 Máy hút chân không
Hút khô Buchi-Đức
5 Máy soi u v Nhận biêt những nhóm chât hữu cơ mang màu
Aqualytic- Đức
6 Máy quay cât chân không
Đê loại bỏ dung môi hay cô đặc để thu được dịch đặc hoặc chất sạch
Buchi- Đức
7 Bộ chưng cât Chưng cât thu dung môi sạch M erck - Đức
8 Tủ hút Hút mùi của những chât độc hại Việt Nam
Bảng 2: Các dụng cụ chỉnh sử dụng trong phòng thí nghiệm
STT Tên dụng cụ Loại (ml) Mục đích
1 Pipet 1,2, 5, 10 Lây chính xác lượng dung môi cân dung (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2 Công tơ hút Lây dung môi với lượng nhỏ
3 Quả bóp Hút dung môi
4 Côc 50,100, 250,500... Đ ựng dung môi và các hóa chât cân th iết
5 Bình câu 2 5 ,5 0 , 100, 250 Dùng đê đặt phản ứng
6 Bình tam giác 100, 200, 250,500.. Đựng dung môi và các hóa chât cân thiết
7 Ong đong 50, 100 Đong các loại dung môi
8 Ông Nghiệm Đựng các chât khi chạy cột
9 Giá đỡ Dùng đỡ cột phản ứng và cột chạy săc
ký
10 Cột săc ký Dùng đê tách chât
11 Phêu thủy tinh Rót dung môi
12 Đũa thủy tinh Dùng đê khuây
2.3. Định tính phản ứng và kiếm tra độ tinh khiết của các họp chất bằng sắc kí lóp mỏng
Sắc kí lóp mỏng (SKLM) được sử dụng đế định tính chất đầu và sản phẩm. Thông thường chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc và sự phát quang khác nhau. Dùng sắc kí lớp mỏng để kiểm tra phản ứng. Giá trị Rfcủa các chất phụ thuộc vào bản chất của các chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động. Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi đế tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết đế tinh chế các chất.
Sắc kí cột (SKC) nguyên tắc dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất đối với chất hấp phụ để tách các chất ra riêng biệt. Trong sắc kí cột, chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong ống hình trụ (gọi là sắc kí cột). Với cột hấp phụ người ta có thể triển khai một dung môi, hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh chảy liên tục.
Dụng cụ chính của sắc kí cột là cột để nhồi chất hấp phụ để làm bằng thủy tinh. Cột có thế là những ống hình trụ dài 30-100 cm đường kính từ 1-8 cm tùy theo chiều dài cột tỉ lệ giữa đường kính.
Cột đem dùng phải thật sạch, đối với chất hấp phụ là nhôm oxit, có thể dùng phương pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thẳng đứng, chắc chắn. Đồ lượng AI2O3 qua phễu, theo một ống đô vào đáy cột. Rót từ từ đều đặn đế tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phang không có chỗ rỗng, chỗ dày, chỗ mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột người ta có thể dùng một đũa thủy tinh đầu gắn với một nút cao su và gõ nhẹ đều vào thành cột cho đến khi nhận được một chiều cao nhất định.
2.4. Định lượng phản ứng
Phương pháp định lượng :
+ Cân chính xác khối lượng của các chất tham gia phản ứng theo đương lượng đã cho trước.
+ Tính khối lượng của sản phẩm theo lý thuyết.
+ Sau khi phản ứng kết thúc, tách chiết và tinh chế sản phẩm ta thu được sản phẩm tinh khiết. Cân chính xác khối lượng sản phẩm thực tế thu được.
+ Tính hiệu suất phản ứng theo công thức:
h = — x 100%
™ ỉ t
Trong đó: h: hiệu suất (%)
mtt: khối lượng thực tế
mlt: khối lượng lỷ thuyết
2.5. Phương pháp thực nghiệm
2.5.1. X ác định nhiệt độ nóng chảy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng họp được đo trên máy đo trên máy Gallenkeamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện hóa học - Viện Hàn Lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam.
2.5.2. Phố hồng ngoại (IR)
Phố IR của các chất nghiên cún được ghi trên máy Impact 410 - Nicolet, tại phòng thí nghiệm Phố hồng ngoại Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn.
2.5.3. Pho cộng hưỏĩig từ hạt nhân (NMR)
Phổ ‘H-NMR (500M Hz) và l3C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO và TMS là chất chuẩn, tại phòng Phố cộng hưởng từ hạt nhân - Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Phố khối của các chất nghiên cứu được ghi trên LC - MSD - Trap - SL tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam 2.6. Tổng hợp Metformin hydrochloride. I c h3 I H I- N 2 / N 3 NH2 .HC1 h3c \\ [] NH NH
Hỗn hợp của dimethylamine hydrochloride (50g; 0,61 mol) và dicyano diamide (51,5g; 0,61mol) được đun trực tiếp ở nhiệt độ 140oC trong 6h nhận được sản phâm thô dạng đông đặc màu trắng. Hỗn họp phản ứng được làm lạnh bằng nước đá đưa về nhiệt độ phòng. Sản phẩm thô được tinh chế trong dung môi thích hợp thu được sản phẩm sạch metformin hydrochloride với hiệu suất phản ứng là 70%.
Sản phầm là tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 225-226°C.
1H-NMR (500 MHz, DM SO), ỏ (ppm): 2,91 (6H, s, 2x CH3).
13C-NMR (125MHz, DMSO), ỏ (ppm): 160,0 (C-3); 158,3 (C-2); 37,4
(2CH3).
EI-M S : m/z: [M-HC1]+ = 129
CTPT: C4H,,N5.HC1
2.7. Nghiên cún kết tinh metformin hydrochloride.
M etformine hydrochloride được làm sạch bằng cách kết tinh trong các dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.
2.8. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride.
Liều độc LD50 được nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Đối tượng nghiên cứu
Thuốc thử: chat metformin hydrochloride ở dạng bột trang, hòa tan trong nước cất.
Động vật thực nghiêm:
Chuột nhắt trắng, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng từ 18-22g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
Chuột được nuôi trong phòng thí nghiệm 3 ngày trước khi nghiên cún, được nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương sản xuất, uống nước tự do.
Chuột được cân đê xác định ữọng lượng và được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con.
Phương pháp nghiên cứu.
Xác định LD50 của metformin hydrochloride trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon .
2.9. Nghiên cứu hàm lượng metformine hydrochloride theo phương pháp HPLC-MS)
Xây dụng đường chuấn metformine hydrochloride: Cân 2mg metformin hydrochloride chuẩn được pha loãng trong MeOH với các nồng độ như sau: 2mg/ml, 0.4mg/ml, 0.2mg/ml, o.lm g/m l.
Điều kiện và thiết bị phân tích: Sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent 1100, Detector DAD, bước sóng 254nm. Pha động H 20: MeOH= 35:65
CHƯƠNG III. KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tổng hợp metformine hydrochloride. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng họp metformine hydrochloride theo phương pháp của Shapiro [1]
(so’ đồ 3.1) trong điều kiện không dung môi. Từ 1 mol dicyano diamide và 1 mol dimethyl amine hydrochloride trộn lẫn với nhau được đun ở nhiệt độ: 140oC trong 6h. Hỗn họp phản ứng sau đó được kết tinh trong dung môi metanol nhận được metformin hydrochloride với hiệu suất phản ứng là 70%.
HỉV n - c = n H3S h h c i 140°c . h,c„ r "
h / * H ? H,HC H3C
dicyano diamide dimethylamine hydrochloride metformin hydrochloride
(a) (b) (c),h=70%
Sơ đồ 3.1: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride
Metfomin-DMSO-lH
V
Current Data Parameters
NAME 6Met fomin
EXPNO 1 PROCNO I I ____ F2 - Acquis Dato_ Tim* INSTRUM PROBHD 5 PULPROG TO SOLVENT ion Paramete 20110504 14.41 spect I Multinucl zg30 6‘jb36 DM SO 10000.000 Hz 0.152588 Hz 3.2769001 sec 128 50.000 usee 6.00 usee 295.6 K 1.0 00000 00 sec 0.000 00000 sec 0.01500000 sec — ■ CHANNEL fl ■■■■■■■■ 1H 10.30 usee 0.00 rlB 500.1335009 MHz Processing parameters 32768 500.1300039 MHz \
Hình 1: Pho 1H-NMR của chat metformin hydrochloride.
Phố cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR của chất metformin hydrochloride xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho độ chuyến dịch hóa học của các proton có mặt trong phân tử. Tín hiệu ở ÔH 2,91 ppm (6H, s,) đặc trưng cho proton ở 2 nhóm CH3.
M e t f o r m i n - D 2 0 - C 1 3 C P D IN ST RUM PROBHD PULPROG SOLVENT 384 2 3 1 4 46.541 0 .4 7 9 8 3 6 1.0 4 2 0 8 8 3 8192 1 5 .9 0 0 1 6.00 2 9 6 .5 1 2.00000000 I 0 .0 3 0 0 0 0 0 0 I 1 .8 9 9 9 9 9 9 8 I 0.00000000 I 0 .0 1 5 0 0 0 0 0 I CHANNEL fl 1 2 5 .7 7 1 6 2 2 4 I 5 0 0 .1 3 2 0 0 0 5 I ...
Hình 2: Phố 13C-NMR của chất metformin hydrochloride.
Trên phổ l3C-NMR xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của 4 nguyên tử cacbon bao gồm 2 nhóm mety] ( CH3) tại ÔC (ppm) 37,4 ( C-l và C - l ’ ); 2 nhóm amin C-NH2tại ÔC (ppm) 160,0 (C-3), và 158,3 (C-2).
Phổ khối EI-MS cho pic ion giả phân tử glibenclamide ở m/z 129 [M-
HC1]+ (C4Hi,N5.HC1).
3.2. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride.
Metformine hydrochloride được làm sạch bằng cách kết tinh trong các dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.
Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi aceton.
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong aceton (500ml), hỗn họp được đun hồi lun nhung khó tan. Dung dịch được lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chưa tan hết trong dung môi. Dịch lọc được làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) -ỉ- (- 20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể được lọc và hút khô thu được sản phẩm metformin hydrochloride 12g. Dịch lọc aceton tiếp tục được cô bớt dung môi và kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình như trên thu thêm được 3g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu được là 15g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 30%.
K et tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH.
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong MeOH (500ml), hỗn hợp được đun hồi lưu đến tan, sản phấm tan hoàn toàn trong dung môi MeOH. Dung dịch được lọc nóng đế lọai bỏ các tạp chất, dịch lọc được làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) -T (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể được lọc bằng phễu lọc thủy tinh, hút khô sản phâm thu được sản phâm metformin hydrochloride 33g. Dịch lọc MeOH được cô bớt dung môi tiếp tục được kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình như trên thu thêm được 8g sản phấm. Tống hai lần kết tinh thu được là 41g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 82%.
Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH.
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong EtOH (500ml), hỗn họp được đun hồi lun cho đến tan. Dung dịch được lọc nóng đế lọai bỏ các tạp chất và sản phẩm chưa tan hết trong dung môi. Dịch lọc được làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) -T (-20oC) trong 24h đê kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phấm tinh thế màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể được lọc và hút khô thu được sản phẩm metformin hydrochloride 18g. Dịch lọc EtOH tiếp tục được kết tinh lại sản phẩm lần thứ 2 lặp lại theo qui trình như trên thu thêm được 6g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu được là 24g sản phấm với hiệu suất kết tinh là 48%.
- Sản phẩm thô metformine hydrochloride (50g) lần lượt được hoà tan trong các dung môi nóng aceton, MeOH và EtOH. Dung dịch được lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phâm chưa tan hết trong dung môi. Dịch lọc được kết tinh trong tủ lạnh 24h, lọc bỏ dung môi, hút khô nhận được tinh thể metformine hydrochloride màu trắng với hiệu suất kết tinh trong aceton là 30%, trong MeOH là 82% và trong EtOH là 48%. Như vậy, metformine hydrochloride được kết tinh trong dung môi MeOH cho hiệu suất kết tinh đạt 82% và độ tinh khiết khoảng 99,8% ( được đánh giá bằng phương pháp HPLC-MS).
3.3. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride.
Liều độc LD50 được nghiên cún tại Khoa Sinh học, Truong Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngiên cứu trên cơ thế : chuột nhắt trắng, cả hai giống đực và cái, cơ thể khỏe m ạnh, trọng lượng từ 1 8-22g do V iện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
Chuột được nuôi trong phòng thí nghiệm 3 ngày trước khi nghiên cứu, được nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương sản xuất, uống nước tự do.
Chuột được cân để xác định trọng lượng và được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con.
Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Từng lô chuột nhắt được uống thuốc thử theo liều tăng dần từ 900m g/kg thể trọng đến 2100m g/kg thể trọng, uống 3 lần trong 24 giờ, mồi lần uống cách nhau ít nhất 2 giờ.
Theo dồi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7.
Ket quả nghiên cún cho thấy sau khi uống thuốc, ở nhũng lô dùng thuốc với liều thấp dưới 900mg/kg thế trọng, chuột có giảm hoạt động, run nhưng sau khoảng 30 phút lại ăn uống và hoạt động bình thường, đi ngoài phân khô. Ở những lô chuột uống thuốc thử liều cao, chuột giảm vận động, run rõ rệt, tai và đuôi tím tái, phân nhão. Từ liều llOOmg/kg trở lên có chuột chết trong vòng 72 giờ. Số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ được trình bày như bảng
LST T
Liều dùng (mg/kg) Số chuột/lô số chuột chết Tỷ lệ %
1 900 10 0 0 2 1100 10 1 10 3 1300 10 2 20 4 1500 10 4 40 5 1700 10 7 70 6 1900 10 8 80 7 2100 10 10 100
Bảng 1: Bảng kết quả thử độc tính cấp của metformin hydrochloride
Từ bảng kết quả , xây dụng được đồ thị về mối tương quan giữa liều dùng và số chuột chết như sau:
Hình 3: Đồ thị về m ối tương quan giữa liều dùng và số chuột chết
Với R2 = 0,9776 đã cho thấy hai đại lượng này có mối tương quan tuyến tính, do đó ta có thể sử dụng phương trình y = 0,0088x - 8,5536 để tính được LD50 = 1540mg/kg.
Như vậy ta có thể đi đến kết luận:
Độc tính cap LD50 của metformine hydrochloride là: 1540mg/kg
3.4. Hàm lưựng metformin hydrochloride theo phương pháp HPLC.
Định lượng metformin hydrochloride bằng HPLC sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent 1100, Detector DAD, bước sóng 254nm. Pha động H 20: