Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đắng hướng, trong điều kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện trường chỉ còn dao động theo một phương nhất định được gọi là ánh sáng phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần.
Mặt phắng chứa tia sáng và phương dao động của vectơ điện trường được gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phắng chứa tia sáng và vuông góc với mặt phang dao động gọi là mặt phang phân cực.
Khi cho ánh sáng phân cực thắng đi qua dung dịch một chất quang hoạt thì mặt phang phân cực sẽ bị quay một góc a. Tuỳ theo chất quang hoạt mà góc quay này có thế sang phải (+) hay sang trái (-). Độ lớn củakk góc quay a phụ thuộc vào nồng độ c (g/lOOml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung môi) 1, nhiệt độ t và chiều dài sóng X:
- r * C ỉ
ơ. = [ccl —
1 * 100
1.3.3. Phố cộng hưởng từ hạt nhân
(Nuclear Magnetìc Resonancespectroscopy, NMR)
Phố cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ nói chung và họp chất thiên nhiên nói riếng. Với việc sử dụng kết họp các kỹ thuật phồ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hưởng ở các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (]H và l3C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ
dịch chuyển hoá học. Ngoài ra, đặc trung của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau.
> Phổ 1H - NM R: Trong phổ 'h - NMR, độ dịch chuyển hoá học (ô) của các proton được xác định trong thang từ 0 đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trung riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau vì vậy chúng được biếu diễn bằng một độ dịch chuyển hoá học khác nhau. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
> Phổ 13c - N M R: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ l3C - NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phố proton (từ 0 đến 240 ppm).
> Phổ DEPT: Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khac nhau. Trên các phố DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất. Tín hiệu phố của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 thì nằm về phía đối diện trên phổ DEPT 1350. Còn trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
> Phô 2D - NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều.
> Phô HMBC: Đây là phố biểu diễn các tương tác xa của c và H trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phố này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
> Phô HSQC: Đây là phổ biểu diễn các tương tác của c và H liên kết trac tiếp với nhau trong phân tử. Như ở phố HMBC, nhò’ vào các tương tác
trên phố này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
1.3.4. Phố khối lượng (Mass spectrocopy, MS)
Phổ khối lượng được dùng khá phổ biến để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phố này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác dựa vào đó người ta có thế xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại cấu trúc hoá học các hợp chất.
> Phô E ỉ - MS: Dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV.
> Pho ESI - MS: Còn được gọi là phố khối lượng phun mù điện tử. Phố này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phô EI - MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trung cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ phá vỡ.
CHƯƠNG II. THỤC NGHIỆM
2.1. Mục tiêu của khóa luận
- Nghiên cứu tổng hợp thuốc chữa bệnh tiểu đường metformin hydrochloride.
- Ngiên cứu kết tinh m etform in hydrochloride trong các dung môi khác nhau.
- Đưa ra quy trình tông hợp với hiệu suất tối ưu.
- Nghiên cứu xác định cấu trúc các hợp chất tổng hợp được bằng phương pháp hóa lý hiện đại như phố cộng hưởng từ hạt nhân ('H-NM R).
- Xác định độc tính cap LD50 của thuốc chữa bệnh tiểu đường metformin hydrochloride
2.2. Phưong pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị Phương pháp nghiên CÚ01
Thực hiện các phương pháp tống họp hữu cơ như: phản ứng bảo vệ nhóm chức, phản ứng thủy phân, phản ứng khử, phản ứng thế, phản ứng cộng... tại Phòng thí nghiệm Hoá Dược-Viện Hoá học-Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, nhằm tồng họp một số các dẫn xuất của diketopiperazine.
Cấu trúc của sản phẩm được xác định nhờ các phương pháp phồ vật lý hiện đại như 1H-NMR. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Độ sạch của sản phấm xác định nhò’ các phương pháp sắc kí như TLC, HPLC, GC-MS, LC-MS.
Hóa chất và dung môi.
Các hoá chất dùng cho tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và thuộc loại phân tích dùng cho phân tích.
Bột silica gel cho sắc ký cột 100 - 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel đế nhôm Art. 5554 DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck).
Thiết bị và dụng cụ
Bảng l ĩ Các thiết bị chính sử dụng trong phòng th í nghiệm
STT Tên Thiêt Bị Mục đích sử dụng Hãng sản xuât
1 Cân điện tử Cân chính xác lượng mâu, bao bì Deshi-Nhật Bản
2 Máy sây/ Tủ sây Làm khô, cô khô Merck- Đức
3 Máy khuây từ/ Cung câp nhiệt, điêu khiên tôc độ Magnetic Strirrer
khuấy cơ khuấy - China
4 Máy hút chân không
Hút khô Buchi-Đức
5 Máy soi u v Nhận biêt những nhóm chât hữu cơ mang màu
Aqualytic- Đức
6 Máy quay cât chân không
Đê loại bỏ dung môi hay cô đặc để thu được dịch đặc hoặc chất sạch
Buchi- Đức
7 Bộ chưng cât Chưng cât thu dung môi sạch M erck - Đức
8 Tủ hút Hút mùi của những chât độc hại Việt Nam
Bảng 2: Các dụng cụ chỉnh sử dụng trong phòng thí nghiệm
STT Tên dụng cụ Loại (ml) Mục đích
1 Pipet 1,2, 5, 10 Lây chính xác lượng dung môi cân dung
2 Công tơ hút Lây dung môi với lượng nhỏ
3 Quả bóp Hút dung môi
4 Côc 50,100, 250,500... Đ ựng dung môi và các hóa chât cân th iết
5 Bình câu 2 5 ,5 0 , 100, 250 Dùng đê đặt phản ứng
6 Bình tam giác 100, 200, 250,500.. Đựng dung môi và các hóa chât cân thiết
7 Ong đong 50, 100 Đong các loại dung môi
8 Ông Nghiệm Đựng các chât khi chạy cột (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9 Giá đỡ Dùng đỡ cột phản ứng và cột chạy săc
ký
10 Cột săc ký Dùng đê tách chât
11 Phêu thủy tinh Rót dung môi
12 Đũa thủy tinh Dùng đê khuây
2.3. Định tính phản ứng và kiếm tra độ tinh khiết của các họp chất bằng sắc kí lóp mỏng
Sắc kí lóp mỏng (SKLM) được sử dụng đế định tính chất đầu và sản phẩm. Thông thường chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc và sự phát quang khác nhau. Dùng sắc kí lớp mỏng để kiểm tra phản ứng. Giá trị Rfcủa các chất phụ thuộc vào bản chất của các chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động. Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi đế tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết đế tinh chế các chất.
Sắc kí cột (SKC) nguyên tắc dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất đối với chất hấp phụ để tách các chất ra riêng biệt. Trong sắc kí cột, chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong ống hình trụ (gọi là sắc kí cột). Với cột hấp phụ người ta có thể triển khai một dung môi, hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh chảy liên tục.
Dụng cụ chính của sắc kí cột là cột để nhồi chất hấp phụ để làm bằng thủy tinh. Cột có thế là những ống hình trụ dài 30-100 cm đường kính từ 1-8 cm tùy theo chiều dài cột tỉ lệ giữa đường kính.
Cột đem dùng phải thật sạch, đối với chất hấp phụ là nhôm oxit, có thể dùng phương pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thẳng đứng, chắc chắn. Đồ lượng AI2O3 qua phễu, theo một ống đô vào đáy cột. Rót từ từ đều đặn đế tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phang không có chỗ rỗng, chỗ dày, chỗ mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột người ta có thể dùng một đũa thủy tinh đầu gắn với một nút cao su và gõ nhẹ đều vào thành cột cho đến khi nhận được một chiều cao nhất định.
2.4. Định lượng phản ứng
Phương pháp định lượng :
+ Cân chính xác khối lượng của các chất tham gia phản ứng theo đương lượng đã cho trước.
+ Tính khối lượng của sản phẩm theo lý thuyết.
+ Sau khi phản ứng kết thúc, tách chiết và tinh chế sản phẩm ta thu được sản phẩm tinh khiết. Cân chính xác khối lượng sản phẩm thực tế thu được.
+ Tính hiệu suất phản ứng theo công thức:
h = — x 100%
™ ỉ t
Trong đó: h: hiệu suất (%)
mtt: khối lượng thực tế
mlt: khối lượng lỷ thuyết
2.5. Phương pháp thực nghiệm
2.5.1. X ác định nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng họp được đo trên máy đo trên máy Gallenkeamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện hóa học - Viện Hàn Lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam.
2.5.2. Phố hồng ngoại (IR)
Phố IR của các chất nghiên cún được ghi trên máy Impact 410 - Nicolet, tại phòng thí nghiệm Phố hồng ngoại Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn.
2.5.3. Pho cộng hưỏĩig từ hạt nhân (NMR)
Phổ ‘H-NMR (500M Hz) và l3C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO và TMS là chất chuẩn, tại phòng Phố cộng hưởng từ hạt nhân - Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Phố khối của các chất nghiên cứu được ghi trên LC - MSD - Trap - SL tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam 2.6. Tổng hợp Metformin hydrochloride. I c h3 I H I- N 2 / N 3 NH2 .HC1 h3c \\ [] NH NH
Hỗn hợp của dimethylamine hydrochloride (50g; 0,61 mol) và dicyano diamide (51,5g; 0,61mol) được đun trực tiếp ở nhiệt độ 140oC trong 6h nhận được sản phâm thô dạng đông đặc màu trắng. Hỗn họp phản ứng được làm lạnh bằng nước đá đưa về nhiệt độ phòng. Sản phẩm thô được tinh chế trong dung môi thích hợp thu được sản phẩm sạch metformin hydrochloride với hiệu suất phản ứng là 70%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sản phầm là tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 225-226°C.
1H-NMR (500 MHz, DM SO), ỏ (ppm): 2,91 (6H, s, 2x CH3).
13C-NMR (125MHz, DMSO), ỏ (ppm): 160,0 (C-3); 158,3 (C-2); 37,4
(2CH3).
EI-M S : m/z: [M-HC1]+ = 129
CTPT: C4H,,N5.HC1
2.7. Nghiên cún kết tinh metformin hydrochloride.
M etformine hydrochloride được làm sạch bằng cách kết tinh trong các dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.
2.8. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride.
Liều độc LD50 được nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Đối tượng nghiên cứu
Thuốc thử: chat metformin hydrochloride ở dạng bột trang, hòa tan trong nước cất.
Động vật thực nghiêm:
Chuột nhắt trắng, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng từ 18-22g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
Chuột được nuôi trong phòng thí nghiệm 3 ngày trước khi nghiên cún, được nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương sản xuất, uống nước tự do.
Chuột được cân đê xác định ữọng lượng và được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con.
Phương pháp nghiên cứu.
Xác định LD50 của metformin hydrochloride trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon .
2.9. Nghiên cứu hàm lượng metformine hydrochloride theo phương pháp HPLC-MS)
Xây dụng đường chuấn metformine hydrochloride: Cân 2mg metformin hydrochloride chuẩn được pha loãng trong MeOH với các nồng độ như sau: 2mg/ml, 0.4mg/ml, 0.2mg/ml, o.lm g/m l.
Điều kiện và thiết bị phân tích: Sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent 1100, Detector DAD, bước sóng 254nm. Pha động H 20: MeOH= 35:65
CHƯƠNG III. KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tổng hợp metformine hydrochloride.
Tổng họp metformine hydrochloride theo phương pháp của Shapiro [1]
(so’ đồ 3.1) trong điều kiện không dung môi. Từ 1 mol dicyano diamide và 1 mol dimethyl amine hydrochloride trộn lẫn với nhau được đun ở nhiệt độ: 140oC trong 6h. Hỗn họp phản ứng sau đó được kết tinh trong dung môi metanol nhận được metformin hydrochloride với hiệu suất phản ứng là 70%.
HỉV n - c = n H3S h h c i 140°c . h,c„ r "
h / * H ? H,HC H3C
dicyano diamide dimethylamine hydrochloride metformin hydrochloride
(a) (b) (c),h=70%
Sơ đồ 3.1: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Metfomin-DMSO-lH
V
Current Data Parameters
NAME 6Met fomin
EXPNO 1 PROCNO I I ____ F2 - Acquis Dato_ Tim* INSTRUM PROBHD 5 PULPROG TO SOLVENT ion Paramete 20110504 14.41 spect I Multinucl zg30 6‘jb36 DM SO 10000.000 Hz 0.152588 Hz 3.2769001 sec 128 50.000 usee 6.00 usee 295.6 K 1.0 00000 00 sec 0.000 00000 sec 0.01500000 sec — ■ CHANNEL fl ■■■■■■■■ 1H 10.30 usee 0.00 rlB 500.1335009 MHz Processing parameters 32768 500.1300039 MHz \
Hình 1: Pho 1H-NMR của chat metformin hydrochloride.
Phố cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR của chất metformin hydrochloride xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho độ chuyến dịch hóa học của các proton có mặt trong phân tử. Tín hiệu ở ÔH 2,91 ppm (6H, s,) đặc trưng cho proton ở 2 nhóm CH3.
M e t f o r m i n - D 2 0 - C 1 3 C P D IN ST RUM PROBHD PULPROG SOLVENT 384 2 3 1 4 46.541 0 .4 7 9 8 3 6 1.0 4 2 0 8 8 3 8192 1 5 .9 0 0 1 6.00 2 9 6 .5 1 2.00000000 I 0 .0 3 0 0 0 0 0 0 I 1 .8 9 9 9 9 9 9 8 I 0.00000000 I 0 .0 1 5 0 0 0 0 0 I CHANNEL fl 1 2 5 .7 7 1 6 2 2 4 I 5 0 0 .1 3 2 0 0 0 5 I ...
Hình 2: Phố 13C-NMR của chất metformin hydrochloride.
Trên phổ l3C-NMR xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của 4 nguyên tử cacbon bao gồm 2 nhóm mety] ( CH3) tại ÔC (ppm) 37,4 ( C-l và C - l ’ ); 2 nhóm amin C-NH2tại ÔC (ppm) 160,0 (C-3), và 158,3 (C-2).
Phổ khối EI-MS cho pic ion giả phân tử glibenclamide ở m/z 129 [M-
HC1]+ (C4Hi,N5.HC1).
3.2. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride.
Metformine hydrochloride được làm sạch bằng cách kết tinh trong các dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.
Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi aceton.
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong aceton (500ml), hỗn họp được đun hồi lun nhung khó tan. Dung dịch được lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chưa tan hết trong dung môi. Dịch lọc được làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) -ỉ- (- 20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể được lọc và hút khô thu được sản phẩm metformin hydrochloride 12g. Dịch lọc aceton tiếp tục được cô bớt dung môi và kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình như trên thu thêm