1.3.1.Các hệ thống tế bào in vitro:
1.3.1.1.Mô sẹo:
Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…). Sự tăng trưởng của mô sẹo được duy trì bởi sự cân bằng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy mà chủ yếu là auxin và cytokinin (Robledo-Paz và cộng sự, 2005) [1].
Trong đời sống của cây nguyên vẹn, mô sẹo được tạo ra khi cây bị tổn thương và mô sẹo giúp làm lành vết thương nhanh chóng. Trong nuôi cấy in vitro, các mô non, đặc biệt là mô của cây mầm ít bị lignin hóa và mô phân sinh thường được sử dụng để tạo mô sẹo. Tuy nhiên, người ta cũng có thể sử dụng những mô đã phân hóa và tế bào của những mô này phải trải qua giai đoạn phản phân hóa để có thể tạo mô sẹo. Sự hình thành mô sẹo thường được quan sát thấy ở vị trí vết cắt trên mẫu cấy nhưng đôi khi mô sẹo cũng được hình thành từ bên trong mẫu cấy và phát triển ra bên ngoài. Nếu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy thích hợp thì mô sẹo tiếp tục tăng trưởng trong tình trạng phản phân hóa mà không phát sinh cơ quan hay tái sinh phôi. Mô sẹo gần như
có khả năng hình thành trên tất cả các loài thực vật, tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy phải phù hợp với từng loài (Pierik, 1987) [10].
Mô sẹo hình thành từ mô hay cơ quan thực vật có khả năng tổng hợp các hợp chất biến dưỡng thứ cấp tương tự cây mẹ do đặc tính này được qui định bởi yếu tố di truyền. Mô sẹo thường không được sử dụng để sản xuất hợp chất thứ cấp mà để dùng làm
nguyên liệu ban đầu nuôi cấy tạo huyền phù tế bào. Tuy nhiên, sự sản xuất các hợp chất thứ cấp từ mô sẹo đã qua vài lần cấy chuyền thường ổn định hơn mô sẹo khởi đầu hay dịch treo tế bào. Mặt khác, người ta thường nuôi cấy mô sẹo để giữ giống vì có thời gian nuôi cấy dài hơn (Razdan, 2003) [13].
1.3.1.2.Biện pháp làm tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào Tối ưu hoá điều kiện môi trường
• Môi trường
Vài trò của một số chất hoá học và các yếu tố vật lý trong môi trường nuôi cấy khác nhau cho từng loại cây. Các yếu tố này bao gồm thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, pH, nhiệt độ, độ thông khí, ánh sáng…Việc thay đổi các thành phần này có thể làm cho tế bào tăng tốc độ tăng trưởng. Ví dụ: trong nuôi cấy dịch treo tế bào Catharanthus roseus (dừa cạn), hàm lượng serpentine khác nhau trong các môi trường khác nhau như: Murashige - Skoog, Blaydes, Gamborg, Velicky và Martin, White.
Saccharose và glucose là nguồn carbon thích hợp trong nuôi cấy mô thực vật. Nồng
độ của chúng cũng ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của tế bào và hàm lượng các hợp chất thứ cấp. Ví dụ: sản lượng acid rosmarinic cao nhất thu được từ huyền phù tế bào của Salvia officinalis (chè Pháp) là 3,5 g/l nếu như trong môi trường có saccharose 5% và 0,7 g/l nếu hàm lượng saccharose 3%.
Trong số những thành phần môi trường khác, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như auxin và cytokinin có ảnh hưởng đáng kể trên sự tăng trưởng của tế bào và khả
năng sản xuất các chất biến dưỡng của tế bào. Ví dụ: khi tăng hàm lượng auxin như 2,4- D trong môi trường sẽ kích thích sự phản phân hoá của tế bào, vì vậy sẽ làm giảm bớt sản lượng các chất biến dưỡng thứ cấp (Collin và Edwards, 1998) [6].
Ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng, pH, nồng độ oxygen cần phải được xác định trong các nghiên cứu khi nuôi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp. Nhiệt độ thích hợp cho việc nuôi cấy mô sẹo và tế bào là khoảng 17 – 25oC. Toivonen và cộng sự (1992) nhận thấy khi giảm nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy sẽ làm tăng lượng acid béo tổng số
trong mỗi tế bào (tính theo trọng lượng khô) [9]. Độ pH tối ưu thuộc vào khoảng 5 – 6 trước khi hấp khử trùng. pH rất cần được kiểm soát trong các hệ thống bioreactor. Ánh sáng cũng cần thiết trong một vài trường hợp. Các bioreactor cải tiến đang được thiết kế
theo cách có thể cung cấp ánh sáng khi cần. Nồng độ oxygen là yếu tố cần được kiểm soát trong nuôi cấy, nhất là trong nuôi cấy bằng bioreactor. Có rất nhiều loại bioreactor
2.Vật liệu và phương pháp
2.1.Vật liệu
2.1.1.Địa điểm và thời gian thực hiện thực hiện đề tài
Địa điểm: Phòng công nghệ tế bào – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Mở
Thành Phố Hồ Chí Minh. Thời gian: 12 tháng
2.1.2.Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây Hoàn ngọc lá tía (Pseuderanthemum bracteatum) có ở Đà
Nẵng, các tỉnh miền Trung và miền Nam.
Nguồn mẫu sử dụng để tiến hành thí nghiệm trong đề tài này được thu từ Đà Nẵng, cây
khỏe, xanh tốt có tuổi 1 năm.
2.1.3.Mẫu cấy
Mẫu là những đoạn đốt thân trưởng thành (đốt thứ 6 tính từ ngọn xuống) của cây hoàn ngọc có tuổi từ 6 tháng đến 1 năm, cây khỏe, xanh tốt và không sâu bệnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 6: Mẫu cấy
2.1.4.Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy gồm:
2.1.4.1.Môi trường chung:
Sử dụng môi trường nuôi cấy MS cơ bản, bổ sung một số thành phần: 1 cm
- Agar Việt Xô: 7,5g/l
- pH: 5,8-5,9
- Than hoạt tính: 1g/l
2.1.4.2.Các loại môi trường:
Chất điều hòa tăng trưởng thực vật được bổ sung tùy theo mục đích thí nghiệm, bao gồm: 2,4-D, BA, NAA với nồng độ thay đổi.
Sử dụng chai thủy tinh 250ml, cho vào mỗi chai 40 ml môi trường, hấp khử trùng
ở 121oC, 1 atm trong 30 phút.
- Môi trường phát sinh chồi từđoạn đốt thân cây Hoàn ngọc:
Bảng 1: Các nghiệm thức được sử dụng trong khảo sát sự phát sinh chồi từ đoạn đốt thân sau khi khử mẫu đạt
Ký hiệu môi trường NAA BA D0 - - D1 0,2 0,2 D2 0,2 0,4 D3 0,2 0,6 D4 0,2 0,8 D5 0,2 1,0 - Môi trường phát sinh rễ từđoạn đốt thân cây hoàn ngọc:
Sau khi các chồi tăng sinh đủ lớn (6 tuần) các chồi sẽđược chuyển tiếp sang môi trường ra rễ. Môi trường ra rễ có thành phần:
MS + 0,2 mg/l NAA + 30 g/l đường + 7,5 g/l agar
- Môi trường khảo sát sự tạo mô sẹo: được tiến hành với 2 chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
lá in vitro của cây hoàn ngọc
Ký hiệu môi trường 2,4-D (mg/l) BA (mg/l) D6 - - D7 0,2 0,2 D8 0,4 0,2 D9 0,6 0,2 D10 0,8 0,2 D11 1,0 0,2 - Môi trường tái sinh rễ từ mô sẹo thân: được tiến hành với chất điều hòa tăng trưởng NAA
Bảng 3: Các nghiệm thức được sử dụng trong khảo sát ảnh hưởng của NAA trong quá trình tái sinh rễ từ mô sẹo thân cây hoàn ngọc
Ký hiệu môi trường NAA (mg/l)
D12 0,2 D13 0,4 D14 0,6 D15 0,8 D16 1,0 D17 0,0
- Môi trường khảo sát ảnh hưởng của BA lên hàm lượng betulin sinh ra trong quá trình tái sinh cây con
quá trình tái sinh cây con từ mô sẹo thân in vitro cây hoàn ngọc
Ký hiệu môi trường BA (mg/l) D18 0,2 D19 0,4 D20 0,6 2.1.5.Điều kiện nuôi cấy [2]. -Nhiệt độ phòng: 25oC ± 2oC -Quang kỳ: 8 giờ/ngày
-Cường độ chiếu sáng: 2500 lux (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Độẩm trung bình: 75-80%
2.1.6.Dụng cụ kỹ thuật
Dụng cụ và trang thiết bịđiều được khử trùng
Môi trường nuôi cấy được khử trùng ở 121oC, 30 phút bằng nồi hấp autoclave. 2.1.7.Dụng cụ và trang thiết bị và hóa chất nuôi cấy :
Cân điện tử (Shinko, Japan, ± 0,01 g)
Máy đo pH (Hanna, Mauritius ± 0,01)
Nồi hấp autoclave (BK75-01, Liên Xô) Lò Viba (Ichiba MW G230S)
Tủ lạnh (Sharp, 400L) Tủ sấy
Tủ cấy vô trùng Máy điều hoà nhiệt độ Đũa thuỷ tinh Ống đong 25 ml, 50 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml. Becher 50 ml, 500 ml, 2000 ml, … Erlen 250 ml Pipet 1 ml, 2 ml, … Micropipet 20 – 100, 100 – 1000 . Dụng cụ cấy: dao cấy, kẹp, đèn cồn, bông thấm, khay cấy, đĩa peptri. Hoá chất Canxi hypocloric Cồn 70o Cồn 96 o MS
2.2.Phương pháp 2.2.1. Khử mẫu : 2.2.1. Khử mẫu :
Cây hoàn ngọc sau khi được đưa về từĐà Nẵng được cắt bỏ lá và những đoạn thân non, chọn những đoạn có đốt thân vị trí 6 (chưa xác định mang chồi nách) cắt thành những
đoạn có kích thước khoảng 2-3cm, cho vào erlen. Các bước khử mẫu:
Thao tác ngoài tủ cấy
- Rửa sạch mẫu cho sạch bụi và các chất dơ dưới vòi nước máy trong 15 phút.
- Ngâm mẫu trong dung dịch nước rửa chén Mỹ hảo có bổ sung 2 giọt Tween trong 10 phút
- Rửa lại bằng nước máy 4-5 lần
- Tiến hành sát trùng bằng cồn 70o trong 30 giây - Rửa lại bằng nước cất vô trùng 3-4 lần
- Sau đó đưa mẫu vào bình erlen, đạy nút lại và đưa vào tủ cấy. Thao tác trong tủ cấy
- Lắc khử trùng bằng canxi hypocloric có nồng độ 7%, 10%, 12%, 15% trong các thời gian khác nhau: 5 phút, 10 phút, 15 phút.
2.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch canxi hypocloric với các nồng độ khác nhau hypocloric với các nồng độ khác nhau
a. Mục đích thí nghiệm:
Xác định thời gian và nồng độ khử trùng của canxi hypocloric đối với đoạn đốt thân của cây hoàn ngọc. Đoạn đốt thân Cây in vitro Mẫu vô trùng Thí nghiệm 1: Khảo sát yếu tố khử trùng
Mô sẹo từ lá Mô sẹo từ thân
Cây con in vitro
Thí nghiệm 6: khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tổng hợp betulin
trong quá trình tái sinh cây con Thí nghiệm2:
Khảo sát sự phát triển chồi từ đoạn đốt thân
Thí nghiệm 3 : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ra rễ
Thí nghiệm 5 : Sự tái sinh rễ từ mô sẹo
Các đoạn đốt thân sau khi đã được khử trùng bên ngoài tủ cấy như nêu ở phần 2.1, đưa vào tủ cấy khử trùng bằng canxi hypocloric nồng độ lần lượt là 7%, 10%, 12%, 15% với các thời gian là 5 phút, 10 phút, 15 phút.
Các mẫu được khử trùng được tiến hành nuôi cấy trên môi trường tạo chồi (D6-D11) c. Chỉ tiêu theo dõi:
Tỉ lệ nhiễm đối với từng mẫu cấy được khử trùng với các thời gian khác nhau và nồng độ
khác nhau của canxi hypocloric.
Sử dụng mẫu cấy đạt tỉ lệ nhiễm ít nhất cho các thí nghiệm về sau.
2.2.2.2.Thí nghiệm 2: Khảo sát sự phát triển chồi từđoạn đốt thân dưới ảnh hưởng của sự
kết hợp 2 chất điều hòa tăng trưởng thực vật NAA và BA
a. Mục đích thí nghiệm:
Đánh giá tác động của sự kết hợp các chất điều hòa tăng trưởng NAA và BA lên đoạn đốt thân của cây hoàn ngọc kích thích quá trình phát triển chồi.
b. Tiến hành thí nghiệm:
Các đoạn đốt thân cây hoàn ngọc sau khi được khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 7,5 g/l agar, 30g/l đường và các chất điều hòa như trong bảng 1.
Sau thời gian nuôi cấy 6 tuần đánh giá sự phát triển chồi và thu số liệu
c. Chỉ tiêu theo dõi:
Quan sát sự phát triển chồi từđoạn đốt thân của cây hoàn ngọc.
2.2.2.3.Thí nghiệm 3: Tăng sinh rễ từ những chồi thu được trên đoạn đốt thân
a. Mục đích thí nghiệm:
Tạo rễ cho thân cây phát triển hoàn chỉnh nhằm thu được nguồn nguyên liệu thân, lá cho thí nghiệm tạo mô sẹo tiếp theo.
vitro và các cơ quan ex-vitro của cây hòan ngọc.
b. Tiến hành thí nghiệm:
Chuyển các cụm chồi thu được từ thí nghiệm 2 sang môi trường MS có bổ sung 7,5 g/l agar, 30g/l đường và chất điều hòa tăng trưởng NAA 0,2g/l.
c. Chỉ tiêu theo dõi:
Hình thái rễ tạo thành.
Hàm lượng betulin trong thân, lá, rễ sau 12 tuần nuôi cấy sau khi khử trùng mẫu. 2.2.2.4. Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ thân non và lá non cây in vitro
a. Mục đích thí nghiệm:
Khảo sát nồng độ và sự kết hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau nhằm tìm ra môi trường tốt nhất tạo mô sẹo từ lá và thân non cây hoàn ngọc.
Tạo nguồn nguyên liệu dùng cho thí nghiệm tiếp sau (biệt hóa mô sẹo thành chồi và rễ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
và so sánh được hàm lượng betulin trong mô sẹo với các cơ quan khác của cây hoàn
ngọc.
b. Tiến hành thí nghiệm:
Thân non (đoạn có màu đỏ) và lá non (mỏng và có màu đỏ) của cây hoàn ngọc in vitro
được cắt ra và làm tổn thương bề mặt bằng cách dùng dao cấy cắt nhiều đường trên mặt lá, cấy úp xuống môi trường MS bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng 2,4-D, NAA, BA theo bảng 2. Nuôi cấy trong 4 tuần.
c. Chỉ tiêu theo dõi:
Trạng thái mô sẹo, trọng lượng tươi mô sẹo, và màu sắc mô sẹo. Hàm lượng betulin có trong mô sẹo tạo thành.
2.2.2.5. Thí nghiệm 5: Tái sinh rễ từ mô sẹo thân non cây hoàn ngọc a. Mục đích thí nghiệm:
nhằm tìm ra môi trường tốt nhất tạo rễ từ mô sẹo thân non và lá non cây hoàn ngọc
in vitro. Sự tạo rễ nhằm mục đích làm tăng khả năng hấp thu BA để làm tăng hàm lượng betulin cho thí nghiệm tiếp sau.
b. Tiến hành thí nghiệm:
Mô sẹo từ thân non và lá non của cây hoàn ngọc sau 4 tuần nuôi cấy thu được từ
thí nghiệm trên được cấy chuyển vào môi trường MS có bổ sung các nồng độ khác nhau của chất điều hòa tăng trưởng NAA theo bảng 3 và bảng 4.
c. Chỉ tiêu theo dõi:
Số lượng rễ mỗi khối mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy, hình thái rễ, màu sắc.
2.2.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng BA lên khả
năng tạo chất thứ cấp betulin trong thân cây in vitro hoàn ngọc
a. Mục đích thí nghiệm:
Chứng minh được vai trò của BA trong quá trình tạo chất thứ cấp betulin trong thân cây hoàn ngọc in vitro.
b. Tiến hành thí nghiệm:
Mô sẹo sau 4 tuần biệt hóa thành rễđược cấy chuyền qua môi trường MS có bổ sung BA có nồng độ thay đổi theo bảng 4. Nuôi cấy tiếp 4 tuần, sau đó thu thân in vitro cây hoàn ngọc làm nguồn nguyên liệu phân tích hàm lượng betulin. Đem thân in vitro thu được sau 8 tuần chiết xuất cao và gửi mẫu chạy sắc ký HPLC-UV.
c. Chỉ tiêu theo dõi:
Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của thân tương ứng với mỗi nồng độ BA bổ sung, so sánh hàm lượng betulin có trong thân cây in vitro dưới tác động của BA với các nồng
Mẫu được sấy khô đến trọng lượng không đổi, gửi mẫu phân tích hàm lượng betulin cho phòng thí nghiệm phân tích trung tâm trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 227 Nguyễn Văn Cừ. Chất betulin chuẩn nhập của Sigma.
Bảng 6: Hàm lượng betulin thu được Ký hiệu mẫu Cơ quan thu Giai đoạn
thu
Phương pháp Ghi chú
Rễ Rễ Cây mới hái (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mẫu
HPLC-UV
Thân Thân Cây mới hái
mẫu
Lá Lá Cây mới hái
mẫu
B1 Lá non Cây in vitro
12 tuần
B2 Lá già Cây in vitro
12 tuần
E1 Rễ Cây in vitro
12 tuần
C1 Thân Cây in vitro
12 tuần C2 Mô sẹo từ thân 4 tuần E2 Thân cây con in vitro Cây con in vitro được tái sinh từ mô sẹo sau 12 tuần
Môi trường tái sinh cây con
được bổ sung 0,2mg/l BA R Thân cây con in vitro Cây con in vitro được tái sinh từ mô sẹo sau 12 tuần
Môi trường tái sinh cây con
được bổ sung 0,4mg/l BA A2 Thân cây con in vitro Cây con in vitro được tái sinh từ mô sẹo sau 12 tuần
Môi trường tái sinh cây con
được bổ sung 0,6mg/l BA
2.2.2.8. Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch :
Mục đích: Chứng minh vai trò kháng khuẩn trong thân cây hoàn ngọc in vitro sau khi tác động 0,4mg/l BA trong quá trình nuôi cấy.