tính các nhóm chất
• Định tính ilavonoỉd
Chiết xuất: Lấy lOml cao lỏng vào cốc có mỏ, pha loãng bằng 50ml nước cất. Đun trên bếp cách thmỷ cho tan hết» dẻ lắng, lọc, Dịch lọc được loại tạp bằng ether dầu hoả. Dịch chiết nước thu được lắc với Ethyỉ acetat 3 lần, mỗi lần 15ml. Gộp các dịch chiết Ethyl acetat lại, bốc hơi dung môi, cắn thu được hoà tan trong 15 ml cồn 90° để làm phản ứng đinh tinh.
- Phản ứng cyanindin: Lấy 2 ml dịch chiết cồn chỏ vào ốrtg tlghiệm khô, thêm một ít bột Mg và 3 giọt HC1 đặc. Đun nóng dđ thấy xuất hiện màu hồng.
Phản ứng dương tính, - Phản ứng với kiềm:
Nhỏ 2 gỉọt dịch chiết vào hai vị trí khác nhau trên tờ giấy lọc, để khô, che kín một vết, hơ một vết lên mỉệng lọ chứa dd NH3 màu vàng tăng lên. Phản ứng dương tính.
Nhỏ 1 ml dịch chiết cồn vào ống nghiệm, thêm vài giọt đd NaOH thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1 ml nước cất tủa tan ra, màu vàng dd tăng lên, Phản ứng dương tính..
- Phản ứng với FeCl3: Cho 1 ml dịch chiết cồn vào ống nghiệm rồi nhỏ 2 giọt FeCl3 vào, lắc đều thấy dd xuất hiện màu xanh đen. Phản ứng dương tính.
- Phản ứng diazo hoá: Nhỏ 3 giọt dịch chiết vào chén sứ rồi thêm 2 giọt thuốc thử diazo mới pha và 3 giọt đd NaOH 10% khuấy nhẹ thấy xuất hiện màu đỏ hồng. Phản ứng dương tính.
• Định tính Coumarin
Chiết xuất: Cho 10 ml cao lỏng pha loãng bằng nước nóng, lọc vào bình gạn rồi chiết 3 lần bằng chloroírom, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết chlorofrom lại, lắc với 20m! dung dịch NaOH 10%, gạn lấy lớp nước. Acid hoá bằng dd HC1 10% đến phản ứng acid (kiểm tra bằng giấy chỉ thị vạn năng), lắc với chlorofrom 3 lần, mỗi lần 10 mL Gộp các dịch chiết Chlorofrom lại rồi cô cách thuỷ đến cắn. Hoà tan cắn vào 5 ml cồn 90° để lảm phản ứng định tính.
- Phản ứng mở vòng ỉacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết: Ồng 1: thêm 0,5ml NaOH 10%
Ổng 2: Để nguyên.
Đun cả 2 ống trong 2 phủt, để nguội và quan sát Óng 1: xuất hiện tủa đục màu vàng.
Ông 2: trong,
Thêm vào cả 2 ống mỗi ống 5 ml nước cất lắc đều. Quan sát thấy Ỏng 1: trong suốt Ông 2: có tủa đục
Àcid hoá ống 1 bằng vài giọt HC1 đặc ống 1 trở lại đục như ổíig 2. Phản ứng dương tính, - Phản ứng diazo hoá; Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 ml dung dịch NâOH 10%, đun cách thuỷ đến sôir để nguội. Thêm 5 giột thuốc thử diazo thấy xuất hiện màu đỏ. Phản ứng dương tính.
giọt dd NaOH 10% sấy nhẹ cho khô. Dùng đồng xu che một nửa vết trên giấy lọc rồi soi trên đèn tử ngoại bước sóng 365 nm trọng 2 phút. Bỏ đồng xu ra quan sát thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che, đem phàn không bị che soi dưới ánh sáng tử ngoại thấy nó sáng dẩn lên bàng phần khỏng bị che.
Qua các phản ứng trên sơ bộ kết luận dịch chiết bài thuốc có Coumarin. • Định tính aỉcaloid
Chiết xuất: Lấy 20 ml cao lỏng bài thuốc cho vào bình gạn, kiềm hoá bằng NH4OH đặc đến pH= 8 - 9, lắc với CHCI3 3 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết CHCI3 cô cách thưỷ tới cắny thêm 10 ml acid HC1 5% thu được dịch nước aciđ, kiềm hoá bàng NH4OH đặc đến pH = 8-9. Lắc CHCI3 3 lần mỗi lần 10 ml, gộp các dịch chiết cô đến cắn. Hoà trong 5 ml HC1 5% để định tính bằng phản ứng hoá học.
- Thuốc thử Dragendorff: lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm* cho vài giọt thuốc thử Dragendorff vào cho tủa màu vàng cam. Phản ứng đương tính.
- Thuốc thử Mayer; lấy 1 m! dịch chiết cho vào ống nghiệm, cho vài giọt thuốc thử Mayer vảo thấy có kết tủa trắng. Phản ứng dương tính.
- Thuốc thử Bouchardat: lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, cho vài giọt thuốc thử Bouchardat vào thấy có kết tủa nâu. Phân ứng dương tính.
Qua các phản ửng trên, sơ bộ kết luận dich chiết bài thuốc có alcaloid. • Đinh tính aeid amin
ĩ
- Phản ứng với thuốc thử Nỉnhydrin: Lấy 2 ral dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Ninhydrin rồi đun cảch thuỷ trong 10 phút, thấy màu tím xuất hiện. Phản ứng
dương tính.
• Định tính Saponin
Quan sát hỉện tượng tạo bọt: Lấy 2 mỉ cao lỏng vào ống nghiệm rồi thêm khoảng 5 ml nước cất, đun nhẹ, để nguội, lắc mạnh. Để yên và quan sát thấy bọt bền vững trong 15 phủi. Phản ứng đương tính.
Chiết xuất; Lấy 10 ml cao hoà vào 50 ml nước cát, đun cách thuý để hoà tan, lọc, dịch lọc ỉắc 3 lần với ether dầu hoả để loại tạp, lấy lớp nước lẳc 3 lần với n - butanol. Bốc hơi n - butanol đến cấn, cắn hoà tan trọng 5 ml Ethanol 90° để làm phản ứng định tính.
+ Phản ứng Libermann - Buchardat: Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, bốc hơi đung môi, hoà tan cắn vào 1 ml anhydrid acetic.đặt nghiêng ống nghiệm 45°, cho thêm đồng lượng H2S04 đặc theo thành ống, thấy xuất hiện vòng phân cách màu đỏ tía. Phản ứng dương tính.
+ Phản úmg Sallcowski: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm từ từ đông lượng H2S04 đặc, giữa lớp phân cách thấy xuất hiện màu tím đỏ, Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng Rosenthaler: Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt vanilin 1% trong cồn, thêm 1 giọt HCỈ đặc, hơ nóng, lắc nhẹ thấy dd xuất hiện màu tím đỏ. Phản ứng dương tính.
Qua các phản ứng trên, sơ bộ kết luận dịch chiết bài thuốc có Saponin. • Định tính Tanin
Chiết xuất; Lấy 10 ml cao ỉỏngs thêm 10 ml nước cất, lắc đều, lọc qua giấy lọc để làm phản ứng định tính:
- Phản ứng tạo tủa với muối kim loại:
+ Phản ứng với FeCỈ3: Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm rồi thêm vài giọt FeCl3 xuất hiện màu xanh đen, phản ứng đương tính.
+ Cho vào ống nghiệm nhỏ l ml dịch lọc, thêm 5 giọt đồng acetat 10% thấy xuất hiện tủa, phản ứng dương tính.
+ Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch lọc rồi thêm 3-4 giọt chi acetat 10% thấy xuất hiện tủa bông, phản ứng dương tính
- Phản ứng tạo tủa với gelatin: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 1 ml dd gelatin 1 % thấy xuất hỉện tủa bông trắng. Phản ứng dương tính. Qua các phản ứng trên sa bộ kết luận dịch chiết bải thuốc có chứa tanin.
• Đinh tính chất béo
Chiết xuất: Lấy 10 ml cao lỏng lắc với ether dầu hoả 3 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết ether cất thu hồi dung môi đến khi còn I ml. Nhỏ một giọt lên tò giấy lọc, để khô quan sát, có vết mờ. Phản ứng dương tính.
• Định tính arid hữu cơ
Lấy 5 ml cao lỏng hoả trong nước, lọc, thêm một ít bột Na2C03 thấy xuất hiện bọt khí. Phản ứng dương tính,
• Định tính caroten, nhân sterol
Chiết xuất: Lấy 10 ml cao lỏng cho vào bình gạn, lẳc 3 lần vói ether dầu hoả, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết ether dầu hoả lại để làm phản ứng định tính.
Lấy 5 ml dịch chiết ether dầu hoả? cô cách thuỷ đến cắn. Nhỏ 2 giọt acid H2SO4 đặc, mặt phân cách có vỏng màu đỏ. Phản ứng duơng tính,
- Định tính sterol: Lẩy 5ml địch chiết ether dầu hoả cô cách thuỷ đến cắn, thêm í ml anhydric acetic, lắc kỹ, nhỏ thêm lml H2SO4 đặc, mặt phân cách có vòng màu đỏ. Phản ứng dương tính. Nhóm chẩt Phản ứng định tính Kết quả Sơ bộ kết 1 Flavonoid - Phản ứng Cyanidin - Phản ứng với FeCỈ3 - Phản ứng với kiềm + + + + + + + + + + + + Có 2 Coumarin - Phản ứng mở vòng lacton - Phản ứng diazo hoá
- Phản ứng tạo huỳnh quang
+ + + + + + + Có
3 Saponin - Phản ứng Libermann-Buchardat - Phản ứng Salkowski
++ + + + + Có
4 Tanin - Phản úmg với FeCl3
- Phản ứng với chì acetat - Phản ứng với đồng acetat
+ + + + + + + + + + + +
Có
5 Alcaloid - Phản ứng vói tt Mayer - Phản ửng với tt Boưchardat
Cỏ
6 Chất béo - Xem vết mờ trên giấy lọc Cỏ
8 Àcid hữu cơ- Phản ứng với Na2CƠ3 Có
Kết quả định tính các nhỏm chất được tóm tắt ở bảng 2:Bảng 2: Kết quả định tính các nhóm
10Nhân sterol - Phản ứng với anhydric acetic và dd H2S04 đđ Có Ghi chú: Phản ứng rõ Phản ứng rất rõ (++): (+ + +):
Qua các phản ứng trên sơ bộ kết luận trong cao lỏng bài thuốc có: favonoid, coumarin, saponin, tanin, acỉd hữu cơ, acid amin, đường khử, chât béo, caroten, nhân sterol. Các nhóm chất có mặt trong cao lỏng bài thuốc đều CÓ mặt trong các vị thuốc của bài thuốc.
Như vậy so sánh thành phần hoá học có trong từng vị thuốc vả thành phần có trong cao lỏng là hoàn toàn tương đồng nhau.
+ Kiểm tra sự có mặt của một số vị thuốc trong cao lỏng bàng SKLM
Căn cứ vào các nhóm chất chính có trong vị thuốc, dùng dung môi thích hợp đề chiết các nhóm chất ở vị thuổc và cao lỏng- Dịch chiểt thu được chấm lên cùng bản mỏng, triển khại trên nhiều hệ dụng mội để tỉm đươc hệ dung môi cho vết rõ vạ tương đương nhau giữa dịch chiết cao lỏng và dịch chiết vị thuổc, Kết quả thu được giúp cho việc kiểm nghiệm bài thuốc được thuận lợi hơn.
• Đương quy vả Tiền hồ: - Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:
+ Dịch chiết Đương quy và Tiền hồ: Cân 10 g bột thô dược liệu rồi ngâm trong Chloroữom qua đêm, lọc lấy dịch chiết, lắc dịch chiết chlorofrom với NáOH IM, lấy dịch chiết nước. Gộp dịch chiết thu được trên đem acid hoá bằng HCL đặc cho pH = 3-4, Lắc với chlorofrom 3 lần, mỗi lần lOml, gộp dịch chiết, rửa lại với nước đến pH trung tính, dịch chiết thu được cô đến cắn, đem hoà cắn voi Methanol để chấm sắc ký.
+ Dịch chíểt của cao lỏng bài thuốc: lấy lOg cao lỏng bài thuốc, pha loãng bằng nước nóng, lọc vào bình gạn rồi chiết bằng chloroform 3 lần, mỗi lần 10ml. Dịch chiết chlorofrom được xử lý theo các bước tương tự như trên dịch chiết chloroform của Đương quy và Tiền hồ.
- Bản mỏng silicagen của hăng Meck, kích thước 4 x 1 0 cm, hoạt hoá trong tủ sấy ở 110°c trong vòng 1 giờ.
- Tiến hành triển khai trên một số hệ dung môi sau:
Hệ I: Chlorofrom : Methanol (5:1)
Hệ ĨI: Toluen : Diethyl ether (4:1) và 3 giọt acid acetic đặc Hệ III: Toỉuen : Diethyl ether: acid acetic 10% (1:1:1)
ĩ
- Triển khai sắc ký: Chấm 3 vết dịch chiết của bài thuốc, Tiền hồ, Đương qụy trên cung một bản mỏng, chạy trên cùng hệ dung môi đến khi cách mép trẽn 1 em, lấy ra, để khô tự nhiên. Hiện vét bằng cách soi dưới đèn uv 365 nm. Trong các hệ dung môi trên thì hệ III tách tốt hơn cả. Kết quả định tính được ghi ở hình II, bảng 3
TT vết Màu sắc (ƯV)
- Sắc ký của Tiền hồ có 7 vết, trong đó có 6 vết có giá trị Rf và màu sắc tương đương với cao lỏng bài thuốc
- Sắc ký của Đương Quy có 6 vết, trong đỏ có 5 vết có giá trị Rf và màu sắc tương đương với cao lỏng bài thuốc.
Sơ bộ kết luận cao lỏng bài thuốc cỏ Tiền hồ và Đương quy • Trần bì:
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:
+ Dịch chiết Trần bì: Lấy 10 gam bột Tràn bì cho vào bình nón, thêm 60ml ethanol 80°, ngâm lạnh trong 24 giờ, sau đỏ lọc lấy địch chiết, bốc hơi cồn. Thêm 20 ml nước cất, lắc đều, lọc. Dịch lọc tha được lắc với ether dầu hoả đến khi lớp ether dàu hoả hét màu để loại tạp, sau đó đun nóng trên bếp cách thuỷ để loại hết ether dầu hoả. Lắc dịch chiết nước với ethylacetat 3 lần, mỗi lần với lOmL Gộp các dịch chiết ethylacetat, cất thu hồi dung môi, hoà tan cắn trong 3 ml methanol để chấm sắc kỹ.
Ẳ * Ằ. ì. Á Bảng 3: Kêt quả săc ký lớp mỏng Đương quy, Tien ho và bàỉ thuôc
+ Dịch chiết cao lỏng; Lấy lOg cao lỏng, thêm 2Qml nước cất, đun nóng cho tan rồi cho vào bình gạn. Các bước tiép theo xử lý như trên dịch chiết Trần bì.Bản mỏng siticagen cùa häng Meck, kích thưởc 2 x 1 0 cm, hoạt hoả trong tủ sấy ở 110°c trong vồng 1 giờ.
- Tiến hành triển khai trên một số hệ dung môi sau:
Hệ I: Tỡluen: Aceton: MeOH: NH4OHđ (10 : 10 :1.5 : 1) Hệ II: Chorofrom: Methanol (9:1)
Hộ III: Chlorofrom : Methanol: NH4OH đ (20 : 3.5 :0.5) Hệ IV: Toluen : Aceton ; Methanol: NH4OH đ(10:10:l.S:l)
BT - BH
Hình 13 : sắc kỷ đồ của Bán hạ và cao lỏng bải thuốc
- Triển khai sác ký: Chấm 2 vết dịch chiết của Bán hạ và cao lỏng bài thuốc trên cùng một bản mỏng, chạy trên cùng hệ dung mối đến khi cách mép trên ĩcm lấy ra, để khô tự nhiên. Hiện vết bằng cách soí dưới đèn ƯV 365 nrru Trong các hệ trên thi hệ IV tách tốt hơn cả. Kết quả định tính được ghi ở hình
Mảu sắc (ƯV)
82
Rf và màu sấc tương đương với bán hạ. Sơ bộ kết luận bài thuốc có Bán hạ.
+ Xác định độ ẩm cao lỏng bằng phưoìig pháp dung moi
Tiến hành: Bộ dụng cụ rửa sạch, sẩy khô lắp theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam III. Cho vào bình cằu 200 ml toiưen, thêm 2ml nước cất và cất trong 2 giờ, tắt bếp để nguội, đọc thể tích nước (V|). Cho tỉếp chính xác khoảng 3 gam cao lỏng vào cất tiếp đến khi mực nước không thay đổi, sau 30 phút, tráng ống sinh hàn bàng 10 ml toluen, cất tiếp 10 phút, để nguội đọc thể tích nước (V2).
Tiến hành 5 mẫu để lấy kết quả trung bình. Cách tính hàm ẩm cao lỏng được ghi ở công thức (2). Ket quả được tóm tát ở bảng 6:
m(g) V, v2 Hàm ẩm(%)
Bảng 5 : Kết quả sắc ký lóp mỏng Bán hạ và cao lỏng bài thuốc
T 1 7 r
* Nhận xét: Săc ký của cao lỏng bài thuôc có 8 vêt, trong đó có 6 vêt có giá trị
+ Đinh Iu^ng tỉnh dầu trong bà! thuốc và môt số vỉ thuốc trong bài thuốc
- Cân các bột thô dược liệu theo đúng tỷ lệ 1 bài thuốc, trộn đều theo
nguyên tắc đồng lượng. Cho vào bình cất tinh dầu. Cho nướcvào ngậpdược liệu, đun cách thuỷ đén khi lượng tinh dầu không tăng thêm. Đe nguội, đọc thể tích tinh dầu ở ống hứng tinh dầu có chia vạch.
- Các bột thô dược liệu: Tiền hồ, Trần bì, Đương quy, Quế nhục được cân chính xác khoảng 100 g và tiến hành cất tinh dàu tương tự như cẩt tinh dầu bài thuốc.
- Cất tinh dầu 3 lần để ỉấy kết quả trung bình. Hàm lượng tinh dầu thể hiện ở bảng 7
m (gam) V (ml) X(%) XTB(%) Bài thuôc 0,243 m ti A 1 A Tiên hô 0,075 Trân bì 0,65 Đương quy 0,23 Quê nhục 1,74
Hàm lượng tinh dầu bài thuốc lả 0,243 %, Tiền hồ là 0,075 %, Trần bì là 0,65 %, Đương quy
Bảng 7: Hàm lirọTig tỉnh dầu của 1 số dược liệu và bài thuốc
là 0,23 %, Quế nhục là 1,74 %
♦ Phân tích các thành phần có trong tinh dầu:
Tinh dầu được làm khan bằng Na2S04 khan vả xác định các thành phần bằng phương pháp sắc ký khối phổ GC/MS, tcết quả được thể hiện ả bảng 8
Peak
Thời gian lưu Hàm Tên chất Có trong dược liệu
17 14.504 0.68 Cinnamyl Quế
22 15.498 0.63 Isobomyl