3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.2 Các thắ nghiệm trong phòng
3.2.2.1 Phân lập và nuôi cấy vi sinh vật gây bệnh trên các môi trường nhân tạo
Phương pháp thu thập mẫu
Trên các ruộng ựiều tra, tiến hành thu thập những cây có triệu chứng ựiển hình, loại bỏ những cây bị bệnh lâu ngày, mỗi cây cho vào một túi P.E và ựánh số thứ tự, những cây triệu chứng bệnh còn biểu hiện bệnh chưa rõ ràng chúng tôi ựánh dấu ựể theo dõi thêm.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 30
Phương pháp ựể ẩm: Sau khi ựiều tra thu thập mẫu bệnh (lá, thân, cành, quả) ngoài ựồng ruộng chúng tôi chọn mẫu bệnh có triệu chứng ựiển hình với từng loại bệnh, rửa sạch, cắt thành mẫu thắch hợp ựể trong hộp petri có lót giấy ẩm, ựể nhiệt ựộ thắch hợp sau 2-3 ngày ( ựể ẩm thường xuyên) ựem kiểm tra dưới kắnh hiển vi ựể xác ựịnh sơ bộ tác nhân gây bệnh.
Phương pháp chế tạo môi trường
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các loại môi trường nhân tạo sau:
* Môi trường PGA. Thành phần:
+ Khoai tây : 200g +Agar: : 20g +đường Glucose : 20g +Nước cất : 1 000ml
điều chế môi trường: Khoai tây gọt sạch vỏ, thái lát mỏng, ựem ựun sôi với nước cất 30 phút, sau ựó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Nước lọc cho thêm nước cất ựủ 1 000ml ựem ựun sôi lại.
Cho các chất vào lần lượt, khuấy ựều cho tan hết agar, sau ựó ựổ môi trường vào bình tam giác hay ống nghiệm có ựậy nút giấy bạc. Sau ựó ựem khử trùng trong nồi hấp áp suất 1,5 atm( 1210) trong 30 - 45 phút, ựể nguội 55 - 60oC trước khi rót ra ựĩa petri
Môi trường ựã khử trùng dùng ựể phân lập hoặc nuôi cấy nấm, có thể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ <00 C
* Môi trường PCA Thành phần
+Khoai tây: 100g +Cà rốt: 100g +Agar: 20g
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 31 + Nước cất : 1 000ml
Cách ựiều chế môi trường tương tự như PDA * Môi trường WA
Thành phần
+ Agar: 20g +Nước cất: 1 000ml
Cách chế tạo: đun agar trong nước cất sau ựó khử trùng. Cách làm tương tự như môi trường trên
Phương pháp phân lập nấm
Thu thập các mẫu bệnh có triệu trứng ựiển hình, còn tươi mới ngoài ựồng ruộng, sau ựó ựể ẩm và nuôi cấy trên môi trường nhân tạo trong phòng thắ nghiệm ựể tạo ựược nguồn nấm thuần khiết làm vật liệu nghiên cứu.
Cách phân lập:
Phân lập nấm theo phương pháp của Kirali - Clemen (Vũ Khắc Nhượng, Hà Minh Trung, 1983).
Bệnh phân lập ựược lấy từ các vết bệnh trên các bộ phận của cây như lá, thân, cành, củ có triệu chứng ựiển hình còn tươi mới ựem về phòng thắ nghiệm rửa sạch. Dùng dao ựã khử trùng cắt miếng có kắch cỡ khoảng 0,2 - 0,3 cm, phần cắt có cả mô khẻo và mô bệnh sau ựó ựem khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 5 - 10 giây, rửa sạch bằng nước cất 2 ựến 3 lần, sau ựó thấm khô bằng giấy lọc vô trùng. Dùng panh vô trùng ựặt vào ựĩa petri chứa môi trường WA. Toàn bộ quá trình phân lập ựược thực hiện trong ựiều kiện vô trùng. để mẫu trong ựiều kiện nhiệt ựộ 250C, ánh sáng thắch hợp, theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh, khi nấm ựã phát triển trong môi trường nuôi cấy, cắt phần ựỉnh sinh trưởng của sợi nấm cấy chuyển sang môi trường khác, tiến hành kiểm tra dưới kắnh hiển vi ựể xác ựịnh nấm gây hại. Giám ựịnh theo tài liệu của Barnett.; H.L, Hunter; B.B (1998) và Frank M, Dugan (2006)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 32 nghiệm khác từ 4 ựến 5 lần cho ựến khi thu ựược nguồn nấm thuần khiết. Quan sát ựặc ựiểm hình thái, màu sắc sợi nấm. Khi ựã thu ựược tản nấm, bào tử phân sinh, cành bào tử và các cấu trúc của nấm chúng tôi tiến hành các thắ nghiệm trong phòng.
3.2.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau ựến sự phát triển của nấm Corynespora cassiicola.
Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (isolate) ựang trong thời kỳ sinh trưởng mạnh cấy nấm vào giữa hộp petri trên các môi trường PCA, PGA, WA, các ựĩa petri ựược ựặt trong ựiều kiện nhiệt ựộ phòng.
+ CT 1: Môi trường WA +CT 2: Môi trường PCA + CT 3: Môi trường PGA
Mỗi công thức ựược nhắc lại 3 lần, mỗi lần 1 hộp petri, ựường kắnh ựĩa petri là 90mm.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ đo ựường kắnh tản nấm (mm) sau cấy 1, 2, 3, 4, 5 ngày.
3.2.2.3 . Ảnh hưởng của pH ựến sự phát triển của nấm Corynespora cassiicola.
Dùng máy ựo pH ựể ựo pH môi trường, sau ựó dùng axit HCl ựể chuẩn ựộ môi trường ựể ựược các ngưỡng pH là 5; 6; 7; 8. Sau ựó ựem hấp môi trường ựã chuẩn với các ngưỡng pH khác nhau và tiến hành thắ nghiệm với các công thức:
+ CT 1: pH5 + CT 2: pH6 + CT 3: pH7 + CT 4: pH8
Cấy nguồn nấm thuần khiết với ựường kắnh lỗ ựục 5mm vào giữa các hộp petri có chứa môi trường PGA với các ngưỡng pH khác nhau.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 33 Mỗi công thức ựược nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri, ựường kắnh ựĩa petri là 90mm, các ựĩa petri ựược ựặt trong ựiều kiện nhiệt ựộ phòng.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ đo ựường kắnh tản nấm (mm) sau 1; 2; 3; 4; 5 ngày cấy.
3.2.2 4. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến sự phát triển của nấm Corynespora cassiicola
Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết ựã phân lập ựược, cấy vào giữa các hộp petri có chứa môi trường PGA. Sau khi cấy các hộp petri ựược ựặt trong tủ ựịnh ôn với các ngưỡng nhiệt thắ nghiệm: 200C, 250C, 300C, 350C.
CT 1: 200C CT 2: 250C CT 3: 300C CT 4: 350C
Mỗi công thức ựược nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri, ựường kắnh ựĩa petri là 90mm.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ đo ựường kắnh tản nấm (mm) sau 1; 2; 3; 4; 5 ngày cấy.
3.2.2.5. Thắ nghiệm lây bệnh nhân tạo
Phương pháp lây bệnh trên quả cà chua của nấm Corynespora casiicola
Chọn quả cà chua ở khu thắ nghiệm ựồng ruộng khoa Nông Học - Trường đại Học Nông nghiệp Hà Nội ựể ựảm bảo trong quả không có thuốc hóa học, thuốc trừ bệnh. Chọn những quả cà chua không có vết bệnh, không bị sâu hại hay có vết nứt. Sau khi lây với nấm Corynespora cassiicola với 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần lây 10 quả cà chua.
Thực hiện lây bệnh theo quy tắc Kock.
Theo phương pháp phun dịch bào tử lên quả với mật ựộ bào tử ựạt 105 bào tử trên 1ml.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 34 Lây bệnh nhân tạo: Dịch bào tử thu ựược cho vào bình phun có áp lực 1,5 atm, phun ựều trực tiếp lên quả ( trước khi phun lây bệnh cho thêm 1 - 2 giọt twin 80 bão hòa vào dung dịch bào tử ựể tăng ựộ bám dắnh). Thời gian tiến hành lây bệnh nhân tạo vào chiều mát. Sau khi phun dịch bào tử, chờ cho quả khô, dùng túi nilon chụp từng quả ựể giữ ẩm sau 24h mở túi chụp ra. Tiến hành theo dõi sự phát sinh của nấm ở các công thức.
CT 1: Lây nấm C.cassiicola lên quả có sát thương. CT 2: Lây nấm C.cassiicola lên quả không sát thương CT 3: ( đC) Không lây nấm C.cassiicola.
Chỉ tiêu theo dõi: Số ngày biểu hiện bệnh ở các công thức, sự khác nhau về biểu hiện bệnh giữa các công thức, tỷ lệ phát bệnh.