Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng 1700-1750 cm- 1…
1.4.2.Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, những phương phápchủ yếu được nêu ra dưới đây:
-Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV.
-Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn pha thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
-Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
-Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định píc ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
-Ngoài ra, hiện nay ngưòi ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kíkhí -khối phổ), LC-MS (sắc kí lỏng-khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược).
1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1
H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
a) Phổ 1
H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hoá học (ọ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
b) Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác
nhau. Thang đo của phổ 13
C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm
Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer).
c) Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT , tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135O. Trên phổ DEPT 90O chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
d) Phổ 2D-NMR
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
-Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
-Phổ 1
H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H- H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
-Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
-Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra, còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người còn sử dụng kết hợp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích so sánh kết hợp khác.
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
CHƢƠNG 2, PHƢƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1. Mẫu thực vật
Cây bòn bọt đã được thu hái tại Lào Cai mẫu cây đã được giám định tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viên Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4
10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
2.2.2. Sắc ký lớp điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silicgel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên.
2.3.2. Độ quay cực [ỏ]D
Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hoá học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.3.3. Phổ khối lượng (ESI-MS)
Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.3.4. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.4. Phân lập các hợp chất
Các bước chiết như sau: mẫu lá cây bòn bọt (Glochidion eriocarpum) (7 kg) được đem nghiền nhỏ sau đó được chiết với MeOH ba lần. Phần dịch chiết được quay khô dưới áp suất giảm để tạo thành cặn chiết MeOH (600 g). Phần cặn chiết sau đó được phân bố trong nước cất và phân lớp với dung môi CHCl3 thu được cặn chiết CHCl3 (200 g) và cặn nước (400g).
Bổ sung nước và CHCl3 - Chiết MeOH (3x lần) GE1.1 cặn CHCl3 Bột lá khô(7 kg) CHCl3: nước 1/1 Dịch nước GE1.2 GE Cặn MeOH
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
Sơ đồ 2.4.1: Chiết phân đoạn dịch chiết cây bòn bọt
Sơ đồ 2.4.2: Tách chiết các chất từ cặn clorofooc
Cặn clorofooc được tiến hành phân tách thành 06 phân đoạn (F1-F6) bằng sắc ký cột silicagel pha thường gradient nồng độ hexan/axeton (20/1, 10/1, 5/1, 2.5/1, 1/1, và 0/1, v/v). Các hợp chất 18A-GE-12A và 18A-GE- 17A được tinh chế từ phân đoạn F2 (10 g) bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là CHCl3/Aceton/EtOAC: 5/1/1.
2.5. Hằng số vật lý và các dữ liệu phổ của các hợp chất GE1.2: cặn CHCl3 GE1.2: cặn CHCl3 200 g n-hexane/acetone (20/1, 10/1, 5/1, 2.5/1, 1/1, and 0/1, v/v) F1 25 g F2 10 g F3 30 g F5 70 g F6 40 g F4 25 g 18A-GE-12A (10 mg) (18A-GE-18A 15 mg)
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
Các chất đã phân lập được chúng tôi tiến hành phân tích cấu trúc bằng các phương pháp vật lý như sau : Đo điểm nóng chảy, độ quay cực, kết hợp với các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ( 1H-NMR, 13-NMR, DEP 135, DEP 90), hai chiều ( HSQC, HMBC và NOSESY) , phổ khối lượng phun mù điện tử ( ESI).
2.5.1. Hợp chất 1 : 18A-GE-12A: Lup-20(29)-en-1,3-diol
Hợp chất 18A-GE-12A được phân lập dưới dạng chất kết tinh màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 249-250o C. 1H-NMR (500 Hz, CD3OD) ọ (ppm): 3,43 (1H, dd, J = 11,5; 4,5 Hz, H-1); 1,68/1,84 (H2-2), 3,24 (1H, dd, J = 12,5; 4,5 Hz, H-3); 0,58 (1H, dd, J = 11,5; 2,0 Hz, H-5), 1,59 (H-6), 1,38 (H-7), 1,51 (H-9), 1,38/2,18 (H2- 11), 1,14/1,68 (H2-12), 1,68 (H-13), 1,01/1,68 (H2-15), 1,38/1,49 (H2-16), 1,35 (H-18), 2,39 (H-19), 1,27/1,29 (H2-21), 1,20/1,39 (H2-22), 0,96 (s, H- 23), 0,76 (s, H-24), 0,91 (s, H-25), 1,05 (s, H-26), 0,96 (s, H-27), 0,80 (s, H- 28), 4,56 (d, J = 1,0 Hz, Ha-29); 4,68 (d, J = 1,0 Hz, Hb-29), 1,68 (s, H-30). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) ọ (ppm): 79,23 (C-1), 38,28 (C-2), 75,96 (C-3), 39,10 (C-4), 53,2 ( (C-5), 18,20 (C-6), 34,32 (C-7), 41,57 (C-8). 51,69 (C-9), 43,79 (C-10), 24,04 (C-11), 25, (C-12), 37,79 (C-1), 43,12 (C- 14), 27,73 (C-15), 35,83 (C-16), 43,12 (C-17), 48,2 (C-19), (151,03 (C-20), 28,06 (C-23), 15,15 (C-24), 12,10 (C-25), 16,44 (C-26), 14,66 (C-27), 18,25 (C-28), 109,67 (C-29), 19,43 (C-30). 2.5.2. Hợp chất 2 :18A-GE-18A: Glochidone
Hợp chất 18A-GE-18A được phân lập dưới dạng tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 164-165o C 1 H-NMR (500Hz, CD3OD) ọ (ppm): 7,1 (d, J = 10,5 Hz, H-1), 5,78 (d, J = 10,5), 1,53 (H-5), 1,54 (H-6), 1,47/1,53 (H2-7), 1,57 (H-9), 1,38/1,63 (H2-11), 1,73 (H-13), 1,04/1,69 (H2-15) 1.49/1,51 (H2-16), 1,39 (H-18), 2,4
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học (H-19), 1,94 (H-21), 1,21/1,21 (H2-22), 1,13 (s, H-23), 1,08 (s, H-24), 1,06 (s, H-25), 1,11 (s, H-26), 0,95 (s, H-27), 0,81 (s, H-28), 1,69 (s, H-30). 13 C-NMR (125MHz, CD3OD), ọ (ppm): 160,02 (C-1), 125,33 (C-2), 205,67 (C-3), 44,82 (C-4) 53,61 (C-5),19,20 (C-6), 33,94 (C-7), 41,93 (C-8), 44,61 (C-9), 39,72 (C-10), 21,42 (C-11), 25,27 (C-12), 38,40 (C-13), 4,19 (C-14), 27,55 (C-15), 35,67 (C-16), 43,28 (C-17), 48,32 (C-18), 48,07 (C-19), 150,89 (C-20), 29,98 (C-21), 40,15 (C-22), 27,98 (C-23), 21,60 (C-24), 19,38 (C-25),16,64 (C-26), 14,61 (C-27), 18,23 (C-28), 109,70 (C-29), 19,51 (C- 30).
Chƣơng 3 : kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất
3.1.1. Hợp chất 18A-GE-12A: Lup-20(29)-en-1,3-diol
Hợp chất này có màu đỏ tím khi đun nóng và cho phản ứng dương tính sử dụng thuốc hiện màu H2SO4 10% cho phép dự đoán đây là một hợp chất tritecpenoit. Phổ 1
H-NMR cũng đặc trưng cho một hợp chất tritecpenoit. Trong đó, sự xuất hiện của 7 nhóm metyl bậc ba được xác định bởi các tín hiệu singlet cộng hưởng tại 0,96 (H-23 và H-27), 0,76 (H-24), 0,91 (H-25), 1,05 (H-26), 0,80 (H-28) và 1,68 (H-30). Sự chuyển dịch mạnh về vùng trường thấp của nhóm metyl tại 1,68 cùng với sự xuất hiện của 02 proton cộng hưởng tại 4,56 (1H, d, J = 1.0 Hz, Ha-29) và 4,68 (1H, d, J = 2,0 Hz, Hb-29) gợi ý cho sự có mặt của một nhánh isopropenyl. Ngoài ra, hai tín hiệu cộng hưởng tại 3,43 (1H, dd, J = 11,5, 4,5 Hz, H-1) và 3,24 (1H, dd, J =
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
Hình 3.1.1.a1. Phổ 1
H-NMR của hợp chất 18A-GE-12A
Hình 3.1.1.a2. Phổ 1
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 OH
Hình 3.1.1.b. Cấu trúc hóa học của hợp chất 18A-GE-12E
Trên phổ 13
C-NMR của hợp chất 18A-GE-12A xuất hiện các tín hiệu của 30 nguyên tử cacbon. Trong đó, sự xuất hiện của một nhánh isopropenyl được khẳng định bởi các tín hiệu cacbon đặc trưng cộng hưởng tại 151,03 (C-20), 109,67 (C-29) và 19,43 (C-30). Ngoài ra, các tín hiệu cộng hưởng tại 79,23 (C-1), 75,96 (C-3) xác nhận sự có mặt của 02 nhóm oximetin.
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
Hình 3.1.1.c. Phổ 13
C-NMR của hợp chất 18A-GE-12A
Hình 3.1.1.d. Phổ HSQC của hợp chất 18A-GE-12A
Thêm vào đó, sự có mặt 06 nhóm metyl bậc 3 được chứng minh bởi các tín hiệu cacbon cộng hưởng tại 28,06 (C-23), 15,15 (C-24), 12,10 (C-25) 16,44 (C-26), 14,66 (C-27) và 18,25 (C-28). Các số liệu cacbon được gán với các số liệu proton tương ứng thông qua phổ HMQC và kết quả được tổng hợp trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả phổ NMR của 18A-GE-12A
C # Ca,b Ha,c mult, (J = Hz) HMBC (HC) 1 79,0 79,23 3,43 dd (11,5, 4,5) 2, 3, 5, 10, 25 2 37,5 38,28 1,68/1,84
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học 3 75,7 75,96 3,24 dd (12,5, 4,5) 1, 4, 23, 24 4 38,9 39,10 - 5 53,1 53,32 0,58 dd (11,5, 2,0) 4, 6, 10, 23, 24, 25 6 18,0 18,20 1,59 7 34,1 34,32 1,38 8 41,3 41,57 - 9 51,4 51,69 1,51 10 43,5 43,79 - 11 23,8 24,04 1,38 */2,18 m 12 25,0 25,30 1,14/1,68* 13 38,0 37,79 1,68* 14 42,8 43,12 - 15 27,4 27,73 1,01/1,68* 16 35,5 35,83 1,38/1,49 17 42,9 43,12 - 18 48,3 48,54 1,35* 19 47,9 48,20 2,39 m 13, 18, 20, 21, 29, 30 20 150,8 151,03 - 21 29,7 29,98 1,27/1,92 22 39,9 40,21 1,20/1,39 23 14,9 15,15 0,96 s 3, 4, 5, 24 24 27,8 28,06 0,76 s 3, 4, 5, 23 25 11,9 12,10 0,91 s 1, 5, 9, 10 26 16,2 16,44 1,05 s 7, 8, 9, 14 27 14,4 14,66 0,96 s 8, 13, 14, 15 28 18,0 18,25 0,80 s 16, 17, 18, 22 29 109,4 109,67 4,56 d (1,0)/4,68 d (2,0) 19, 20, 30 30 19,2 19,43 1,68 s 19, 20, 29
ađo trong CDCl3, btại 125 MHz, ctại 500 MHz, *tín hiệu bị che khuất, #
số liệu của lup-20(29)-en-1,3-diol [1]
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
Hình 3.1.1.f. Phổ H-H COSY dãn rộng của hợp chất 18A-GE-12A
HO
OH
Hình3.1.1.g. Các tương tác H-H COSY của hợp chất 18A-GE-12A
Từ các dữ kiện thu được cho phép nhận định hợp chất 18A-GE-12A có cấu trúc khung tritecpen lup-20(29)-en và trong phân tử có 2 nhóm oximetin. Phân tích chi tiết các tương tác ghi nhận được trên phổ H-H COSY (hình 2.2.e-g) của hợp chất 18A-GE-12A cho phép ghép nối các mảnh cấu trúc C- 1/C-2/C-3, C-5/C-6/C-7, C-9/C-11/C-12/C-13/C-18/C-19/C-21/C-22 và C- 15/C-16. Các kết quả trên cùng với các tương tác xa nhận được trên phổ HMBC cho phép ghép nối các đơn vị cấu trúc lại với nhau và xây dựng nên cấu trúc tổng thể cả phân tử của hợp chất 18A-GE-12A (hình 2.2.h). Tương tác HMBC từ proton H-25 ( 0,91) sang cacbon C-1 ( 79,23) và từ proton H-
Phan Thị Thanh K31D- Khoa Hoá Học
1 ( 3,43) sang cacbon C-25 ( 12,10) cho phép xác định vị trí liên kết của nhóm hydroyl thứ nhất tại cacbon C-1. Vị trí của nhóm oximetin còn lại được khẳng định tại C-3 bởi tương tác xa ghi nhận được trên phổ HMBC từ các proton metyl H-23 ( 0,96) và H-24 (0,76) sang cacbon C-3 ( 75,96) và từ