Các bước tiến hành:
Lấy 1 khuẩn lạc ở trên cấy chuyển vào 5 mL môi trường LB-K lỏng, nuôi cấy lắc ở điều kiện tối, nhiệt độ từ 27-28oC trong 2-3 ngày.
Thu tất cả các tế bào đã nuôi cấy ở trên bằng cách cho môi trường LB-K lỏng chứa khuẩn lạc vào tube eppendorf, ly tâm từ 0,5-1 phút, tốc độ 12.000 rpm. Lặp lại nhiều lần.
Loại bỏ môi trường LB ở phía trên, các tế bào thu được hòa tan trong 1 mL môi trường MSO lỏng.
Chuẩn bị 20 mL môi trường MSO trên đĩa petri.
Lá thuốc lá in vitro cắt thành các mảnh lá có kích thước ước chừng khoảng 0,5-0,7 cm × 0,5-0,7 cm (loại bỏ các gân lá), chuyển lên đĩa petri chứa môi trường MSO.
Tế bào Agrobacterium hòa trong 1 mL môi trường MSO được cấy chuyển sang môi trường MSO có chứa các mảnh lá, lắc nhẹ bằng tay và ủ trong 10 phút.
Sau khi đồng nuôi cấy, làm khô các mảnh lá bằng cách chuyển chúng lên giấy lọc vô trùng trong 0,5-1 phút. Các mảnh lá đó được nuôi trên môi trường nuôi cấy (MS 104) trong 2 ngày trong tối.
Các mảnh lá sau đó được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc (MS SEL) và nuôi cấy trong 3 tuần để tái sinh chồi ở điều kiện chiếu sáng.
Các chồi tạo thành được cấy chuyển lên môi trường MSR để tạo rễ. Các cây hoàn chỉnh được chuyển sang nuôi cấy trong các bình. Các cây này là các cây đã được tiến hành chuyển gen. Để biết việc chuyển gen có thành công hay không cần phải tiến hành các thí nghiệm kiểm tra (tách chiết DNA của Agrobacterium, chạy PCR với cặp primer đặc hiệu cho insert DNA và điện di sản phẩm PCR trên agarose gel 1 %).