* Nuôi cấy vi khuẩn
hành nuôi cấy các vi khuẩn. Các bước như sau:
Nuôi A. tumenfaciens trong môi trường LB-R trong tổi, ở 28oC, thời gian 48 giờ (nuôi trước khi tiến hành triparental mating 2 ngày).
Nuôi E. coli có mang plasmid helper (pRK 2013) và E. coli có mang vector pBI 121 + insert DNA trong môi trường LB-K (nuôi trước khi tiến hành lai bộ ba 1 ngày).
* Nuôi cấy chung 3 loại vi khuẩn Các bước tiến hành:
Lấy mỗi ống nghiệm nuôi các loại vi khuẩn 1 mL, ly tâm tốc độ khoảng 10.000 rpm, trong 5 giây.
Loại bỏ thể nổi, thêm 1 mL môi trường LB, lắc nhẹ để trộn (để loại bỏ chất kháng sinh). Lập lại 2 bước trên 2 lần. Thêm 300 µl môi trường LB.
3 loại vi khuẩn trên được cấy lên mặt đĩa chứa môi trường LB đặc (đã được chuẩn bị trước các đĩa petri chứa môi trường LB bổ sung 1,5 % agar) không bổ sung chất kháng sinh, mỗi loại vi khuẩn lấy 100 µl. Dàn đều trên bề mặt môi trường đến khi khô hoàn toàn.
Nuôi cấy từ 1-2 ngày tại 26-28oC, đến khi các “thảm” vi khuẩn được hình thành. * Chọn lọc vi khuẩn nuôi cấy bằng cách trộn 3 loại vi khuẩn, sử dụng chất kháng sinh Các bước tiến hành:
Lấy 5 mL MgSO4 10 mM cho lên đĩa petri mới, lấy một ít vi khuẩn trong “thảm” đã nuôi cấy ở trên cho vào để có một dịch lỏng.
Chuẩn bị 4 tube eppendorf vô trùng, cho vào mỗi tube 900 µL MgSO4 10 mM. Tiến hành pha loãng vi khuẩn thành các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4.
Lấy 100 µl mỗi loại vi khuẩn đã pha loãng dàn đều lên 5 đĩa petri chứa môi trường LB-RK bổ sung 2 % agar.
Nuôi trong 2-3 ngày tại 26-28oC trong điều kiện tối để phát triển khuẩn lạc.
Nuôi cấy 1 khuẩn lạc trong 5 mL môi trường LB-RK tại 26-28oC từ 1-2 ngày để thu được sinh khối E. coli, xác định Agrobacterium đã được chuyển gen (nếu chưa sử dụng ngay, thêm vào 15% glycerin và bảo quản ở -70oC).