100µl
1.25U Taq polymerase 100µM mỗi loại dNTP 0.5µM mỗi primer 10µl DNA mẫu 10nM Tris HCl (pH=8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl, 0.001% (Wt/vol) gelatin.
ADN đích 1 Biến tính (94o C-1 phút) 2 Bắt cặp (50o C-1 phút) 1 2 3 4
Phản ứng PCR được thực hiện
30 chu kỳ
• Sản phẩm tạo thành được điện di trên gel agarose 1% nhuộm ethidium bromide hoặc
được lọc bằng Z-probe(Bio-Rad) và lai với DNA probe mã hóa cho gene DTH-18. Probe
listeriolysin O được đánh dấu sử dụng trong PCR. Điều kiện tương tự như miêu tả ở trên ngoại trừ 100µl thể tích phản ứng chứa 90µM
dNTP và 10µM digoxigenin-dUTP. PCR dựa trên gene listeriolysin O dùng để xác định kiểu huyết thanh 4a.
Sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR từ mẫu phô mai có chứa Listeria monocytogenes
sau khi đã làm giàu mẫu
(A). 1µl mẫu (lane 1 đến lane 4), 2µl mẫu (lane 8 đến lane 11) từ dung dịch làm giàu mẫu.
(B) kết quả PCR sau khi thực hiện miễn dịch từ phân tách(IMS) của 100µl mẫu
Listeria (lane 1 đến lane 4).
Trước khi làm giàu mẫu, 25g phô mai phân tích chứa 0 (Bảng A,lane 1 và 8. Bảng B, lane 1), 0.4 (Bảng A, lane 2 và 9. Bảng B, lane 2), 4 (Bảng A, lane 3 và 10. Bảng B, lane 3), 40
( Bảng A, lane 4 và 11. Bảng B, lane 4) CFU/g phô mai. Lane 6 không chứa L.
Sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR từ mẫu phô mai được làm giàu lần 1 và 2.
1µl mẫu (lane 1 đến lane 4), 2µl mẫu (lane 8 đến lane 11) từ dung dịch làm giàu mẫu lần 2.
Kết quả thực hiện PCR sau IMS của 100µl mẫu Listeria (lane 1 đến 4) Trước khi làm giàu mẫu, 25g phô mai
phân tích chứa 0 (Bảng A,lane 4 và 11. Bảng B, lane 4), 1 (Bảng A, lane 1 và 10. Bảng B, lane 1), 10 (Bảng A, lane 2 và 9. Bảng B, lane 2), 100 ( Bảng A, lane 3 và 8. Bảng B, lane 3) CFU/g phô mai. Lane 6 không chứa L.
monocytogenes. Sự kiểm tra khẳng định chứa 0,05µg DNA
Sự định lượng L.monocytogenes với SYBRGreen/Real-Time PCR Assay.Gen
listeriolysin(hly A) được chọn làm mục tiêu để xác định L.monocytogenes.
Mồi xuôi:5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’
Mồi ngược:5’-CACTGCATCTCCGTGGTACTAA-
3’
Được sử dụng để khuếch đại đoạn 113bp của gene hly A(Nogva et al,2000)
Định lượng Real-Time PCR được thực hiện bởi máy luân nhiệt M×3005(Stratagene, La Jolla, CA, USA) trong 25µl thể tích cuối chứa 9,5µl
mẫu DNA, 300mM mồi xuôi và mồi ngược(DNA Technology, Arhus, Denmark) và 12,5µl 2×High power SWBR Green PCR Master M(Applied
PCR bao gồm 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước biến tính ở 950C/15 giây,bắt cặp/ kéo dài ở
600C-60 giây. Phân tích melt-curve giữa 55-950C để kiểm tra sự đặc hiệu của phản ứng khuếch đại. Đường cong chuẩn được xây dựng từ các nồng độ pha loãng của tế bào vi khuẩn và quan sát chu kỳ ngưỡng Ct.
