2.2.1. Nguyên liệu
Dầu gấc nguyên chất sản xuất tại Công ty TNHH Đông Phương, Cần Thơ. Chitosan nguồn gốc Trung Quốc, độ DA > 90%, độ nhớt dung dịch 1% trong acid acetic 1% đạt 13,3 – 14,3 cP.
2.2.2. Hóa chất a. Acid Acetic a. Acid Acetic
Acid acetic, hay còn gọi là etanoic, là một axít hữu cơ, mạnh hơn acid carbonic. Phân tử gồm nhóm methyl liên kết với nhóm carboxyl. Giấm là acid acetic nồng độ từ 2–6%. Giấm được điều chế bằng cách lên men rượu etylic.
Công thức: C2H4O2
Điểm nóng chảy: 16 °C
Mật độ: 1,05 g/cm³
Điểm sôi: 118 °C
Khối lượng phân tử: 60,05 g/mol
b. Chất hoạt động bề mặt
Span 80
Hình 2.1. Công thức cấu tạo của chất hoạt động bề mặt Span 80
Công thức phân tử: C24H44O6
Khối lượng phân tử 428,61g/ mol
Chỉ số OH: 190 – 220 (mg KOH/g) Tỷ trọng: 0.994g/ml ở 20oC Điểm chớp cháy: > 110oC Chỉ số Iot: 60 – 75 (mg Iot/g) Chỉ số HLB: 4.3 Chỉ số xà phòng hóa: 140 – 160 (mg KOH/g)
Hàm lượng nước: 0.5% max
Chỉ số acid: 8.0 max (mg KOH/g)
Tween 80
Hình 2.2. Công thức cấu tạo của chất hoạt động bề mặt Tween 80
Công thức phân tử: C66H124O26
Khối lượng phân tử: 1310 g/mol
Là chất lỏng màu vàng nhạt, không độc hại
Nhiệt độ sôi: 100oC Tỷ trọng: 1.08 g/ml Chỉ số HLB: 15 Điểm chớp cháy: >110oC Chỉ số xà phòng hóa: 45 – 55 (mg KOH/g) Điểm vẩn đục: 93oC
Hàm lượng nước: 3% max
Lecithin
Hình 2.3. Công thức cấu tạo của chất hoạt động bề mặt Lecithin
Có tính tạo nhũ và làm bền nhũ tương
Có màu nâu vàng, khồng độc hại
Phân tán trong nước
Tan tốt trong dầu, các dung môi không phân cực
Ký hiệu: E322
Chỉ số HLB = 3 – 4 ( đối với lecithin phân cực thấp), HLB = 10 -12 (đối với lecithin hiệu chỉnh)
c. Dung môi
n – hexan
Hình 2.4. Công thức cấu tạo của dung môi n – hexan
Là một thành phần quan trọng của xăng. Chất lỏng không màu ở nhiệt độ phòng. Là dung môi không phân cực, dễ bay hơi có mù giống xăng. Tương đối an toàn và phần lớn trơ với các chất khác.
Khối lượng phân tử: 86.18 g/mol Tỉ trọng: 0.655 g/cm3 Nhiệt độ đông đặc: -95oC Nhiệt độ sôi: 69oC Điểm từ phát cháy: 233.9oC Petroleum ether
Hình 2.5. Công thức cấu tạo của dung môi Petroleum ether
Petroleum ether còn được gọi là benzine, naphtha petroleum hay ligroine, là một hỗn hợp hydrocarbon lỏng không màu, dễ bay hơi, dễ cháy, không tan trong nước, thường được sử dụng như một dung môi không phân cực.
Khối lượng phân tử: 87 – 90 g/mol
Khối lượng riêng : 0.625 – 0.660 g/cm3
Nhiệt độ sôi: 20 – 75oC
Aceton
Hình 2.6. Công thức cấu tạo của dung môi Aceton
Aceton là hợp chất hữu cơ. Là một chất lỏng dễ bay hơi, dễ cháy, không màu và là dạng ceton đơn giản nhất.
Điểm nóng chảy: - 95oC
Điểm sôi: 56oC
Khối lượng phân tử: 58.08 g/mol
Cồn tuyệt đối.
\
Hình 2.7. Công thưc cấu tạo của cồn tuyệt đối
Công thức phân tử: C2H5OH
Nồng độ 99.5%
Là chất lỏng không màu, mùi thơm dễ chịu và đặc trưng, vị cay, nhẹ hơn nước
Khối lượng riêng: 0.7963g/ml ở 15oC
Nhiệt độ sôi: 78.39oC, dễ bay hơi, hóa rắn ở -114.15oC
Tan trong nước vô hạn, tan trong eter và chloroform hút ẩm, dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa có màu xanh da trời.
d. Kiềm
NaOH
Natri hydroxit tạo thành dung dịch kiềm mạnh khi hào tan trong dung môi như nước.
Điểm nóng chảy: 318oC
Khối lượng phân tử: 39.997 g/mol
Điểm sôi: 1.388oC
Có thể tan trong nước, methanol, etanol.
KOH
Kali hydroxit là một hydroxit kiềm mạnh có tính ăn mòn. Là một chất rắn kết tinh màu trắng, ưa ẩm.
Điểm nóng chảy: 406oC
Khối lượng phân tử: 56.1056 g/mol
Điểm sôi: 1.327oC
2.2.3. Dụng cụ, trang thiết bị
Bảng 2.1. Dụng cụ và trang thiết bị phục vụ nghiên cứu. Dụng cụ Trang thiết bị
Pipet 10ml, đồ bóp nhựa. Con cá từ.
Cốc thủy tinh. Ống đong 250ml. Đũa thủy tinh. Ống hút nhựa.
Bình định mức 10ml. Ống nghiệm nút xoáy. Giấy lọc, giấy bạc.
Đĩa nhựa, muỗng, rây lọc, thau nhựa, khăn giấy.
Ống nhỏ hạt 6 đầu.
Băng keo, giấy ghi nhãn, túi đựng mẫu.
Phểu lọc thủy tinh. Cốc sứ 30ml có nắp. Bình hút ẩm.
Găng tay, khẩu trang y tế. Ống đong 250ml. Ống ly tâm. Cân phân tích. Cân kỹ thuật. Máy khuấy từ. Tủ lạnh.
Thiết bị đồng hóa (hiệu IKA T18 Basic, ULTRA_TURRAX).
Bể ổn nhiệt (tủ ấm 40 – 45oC). Tủ sấy 105oC.
Kính hiển vi soi nổi: Model Motic BA 300; kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính.
Phần mềm chụp ảnh MC Camera. Phần mềm đo kích thước hạt ImageJ 14.6.
Máy đo quang UV-VIS Máy đo lưu biến.
Máy Vortex.
Máy đo độ nhớt hiệu
BROOKFEIELD dòng Viscometer – DV – I Prime, mode LVDV_I, serial AP 6522124.
Máy đo pH cầm tay. Máy ly tâm.
Thiết bị lọc hút chân không. Máy nghiền mẫu khô. Máy đánh siêu âm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Quy trình tạo vi nang 2.3.1. Quy trình tạo vi nang
Hình 2.1: Quy trình tạo vi nang sử dụng đầu nhỏ giọt 6 đầu Thuyết minh quy trình:
Dung dịch chitosan 3,5% được chuẩn bị trong acid acetic 1%, để tan hoàn toàn qua đêm. Nhũ tương chitosan – dầu gấc được tạo thành bằng cách đồng hóa hỗn hợp (chitosan, dầu gấc 3%, chất nhũ hóa 5%) tại tốc độ 19000 v/ph trong 10 phút. Nhũ tương sau đó được nhỏ giọt vào dung dịch kiềm NaOH hoặc KOH với các nồng độ khác nhau (0.5M, 1M, 1.5M, 2M). Hạt được ngâm trong kiềm 60 phút, rửa bằng nước cất 3 lần và để khô tự nhiên.
2.3.2. Phân tích tính chất hạt vi nang
2.3.2.1. Phân tích hàm lượng beta – carotene trong hạt
Hàm lượng beta-carotene trong hạt được xác định theo phương pháp xây dựng bởi Nguyễn Thị Hiền (2014). Beta-carotene được trích ly với hỗn hợp Petroleum ether/ Aceton (1/1 v/v). Dịch chiết được mang xác định độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 451nm. Hàm lượng beta-carotene được tính từ đường chuẩn sau :
Hàm lượng beta-carotene trong dịch mang đo (µg/ml) = BC = 55,968*A451 + 8,2593 Hàm lượng beta-carotene trong mẫu (mg/g) = BC*1000*v*f/m
Trong đó :
- v là thể tích dịch chiết (ml) - f là hệ số pha loãng
- m là khối lượng mẫu
2.3.2.2. Phân tích tính lưu biến của hạt.
Tính chất lưu biến của hạt được đo trên máy đo lưu biến CR-500DX. Cường độ lực nén sử dụng 1N, tốc độ di chuyển đầu do 60 (mm/min).
Các thông số khảo sát: - Lực tạo gel (Gel strength) - Độ cứng (Hardness)
2.3.2.3. Phân tích kích thước và hình dạng hạt.
Kích thước và hình dạng của hạt được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi sử dụng camera và phần mềm chụp ảnh Future WinJoe. Hình ảnh sau đó được xử lý trên phần mềm ImageJ 14.6.
Các thông số được xác định bao gồm:
- Phân bố kích thước hạt (theo diện tích – Area)
- Độ tròn – Circularity (Tỷ lệ giữa chu vi thực của hạt và chu vi của đường tròn có cùng diện tích, có giá trị từ 0 – 1).
oĐộ tròn > 0,96: Hạt tròn (Primery spheres)
oĐộ tròn <0,96 và 0,896: hạt méo (Primery misshapen)
oĐộ tròn <0,896: Kết tụ (Agglomerates)
- Tính liên tục của bề mặt – Solidity (Tỷ lệ giữa diện tích thực của hạt và diện tích đa giác ngoại tiếp nhỏ nhất, có giá trị từ 0 – 1).
2.3.3. Xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần. Số liệu được xử lý trên phần mềm Statistica 7.1.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của điều kiện đông tụ tới quá trình tạo hạt 3.1.1. Ảnh hưởng của điều kiện đông tụ tới hiệu quả tạo hạt
Chitosan có khả năng tạo hạt khi tiếp xúc với dung dịch kiềm. Ở đây, chúng tôi khảo sát 2 loại dung dịch kiềm có hằng số phân lý khác nhau: KOH và NaOH. Nồng độ khảo sát trong khoảng 0.5M – 2.0M. Hiệu quả tạo hạt được đánh giá thông qua hàm lượng beta-carotene có trong hạt. Ba loại chất nhũ hóa đồng thời được khảo sát bao gồm: Span80, Tween80 và Lecithin (sau đây được gọi là mẫu Span, mẫu Tween và mẫu Lecithin).
Hình 3.1. Hàm lượng beta-carotene trong hạt tại các nồng độ kiềm khác nhau. (A) NaOH; (B) KOH
Thảo luận:
Ảnh hưởng của dung dịch kiềm
Khi trích ly mẫu Span, Tween, Lecithin nhỏ giọt trong dung dịch kiềm NaOH và KOH với các nồng độ 0.5 M, 1 M, 1.5 M, 2M với dung môi PE – acetone thì phổ dịch chiết beta–carotene (hấp thụ ánh sáng UV – Vis ) của các mẫu hạt vi nang thể hiện sự đồng dạng với phổ hấp thụ ánh sáng UV – Vis của mẫu dầu gấc ban đầu. Điều này chứng tỏ quá trình tạo hạt không bị ảnh hưởng tới tính chất của dầu gấc, có thể đảm bảo an toàn được cấu trúc của hoạt chất.
Carotenoid là hoạt chất có tính bền trong môi trường kiềm. Phân tích ANOVA cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa (p = 0.05) về hàm lượng beta- carotene trong hạt giữa các nồng độ kiềm sử dụng cùng một chất nhũ hóa. Nói cách khác, nồng độ kiềm không ảnh hưởng tới hiệu quả bao gói.
Ảnh hưởng của chất nhũ hóa
Quan sát ảnh hưởng của chất nhũ hóa tới hiệu quả tạo hạt, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt giữa các chất nhũ hóa sử dụng. Sự khác biệt này có phụ thuộc vào môi trường kiềm dùng để tạo hạt. Cụ thể, ở hầu hết các nồng độ kiềm sử dụng, với dung dịch NaOH, chất nhũ hóa cho hiệu quả bao gói cao nhất là Lecithin, trong khi đó Span80 và Tween80 không có sự khác biệt rõ rệt. Đối với dung dịch KOH, Span80 lại cho hiệu quả thấp nhất trong khi Tween80 và Lecithin không thể hiện sự khác biệt rõ rệt. Do đó, tùy vào điều kiện tạo hạt, chúng ta có thể lựa chọn chất nhũ hóa phù hợp. Ví dụ, đối với NaOH nên dùng chất nhũ hóa là Lecithin; đối với KOH có thể sử dụng cả Tween80 và Lecithin.
3.1.2. Ảnh hưởng của điều kiện đông tụ tới hàm lượng beta-carotene trong hạt theo thời gian bảo quản
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng beta-carotene có trong hạt theo thời gian bảo quản. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.2. Tỷ lệ carotenoids trong hạt được thể hiện trong Hình 3.3.
Dung dịch kiềm NaOH, chất nhũ hóa Tween 80
Hình 3.3. Tỷ lệ carotenoids trong hạt theo thời gian (LYC) Lycopen, (BC) Beta-carotene
Thảo luận:
Từ Hình 3.2, ta có thể nói rằng càng theo thời gian, thời gian càng lâu hàm lượng beta–carotene có xu hướng giảm dần. Mẫu NaOH có hàm lượng beta- carotene giảm ngay từ ngày thứ 2 (từ 10 – 30%) trong khi hàm lượng beta-carotene trong mẫu KOH sau 2 ngày không có sự thay đổi. Tuy nhiên, sau 7 ngày cả hai mẫu KOH và NaOH đều có hàm lượng beta-carotene sụt giảm từ 40 – 60%.
Thành phần carotenoids trong hạt hay nói cách khác là tỷ lệ giữa beta- carotene và lycopene (được tính theo công thức dựa trên sự hấp thụ quang tại hai bước sóng đặc trưng 450nm và 503nm) không có sự khác biệt giữa các nồng độ kiềm khác nhau (Hình 3.3) nhưng có sự tăng tỷ lệ lycopene (tương ứng với sụt giảm beta-carotene) theo thời gian. Cụ thể, sau 2 ngày, tỷ lệ lycopene/ beta-carotene đạt 30/70; sau 5 ngày và 8 ngày tỷ lệ này tăng lên 40/60. Đặc biệt, đối với mẫu NaOH 2M, tại thời điểm 8 ngày, tỷ lệ lycopene/ beta-carotene tăng vọt đạt 90/10. Cần tiến hành phân tích sắc ký để có thể kết luận được sự thay đổi thành phần carotenoids trong hạt theo thời gian.
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện đông tụ tới tính lưu biến của hạt
Tính chất hạt được đánh giá thông qua các kết quả đo tính lưu biến của hạt bao gồm các thông số: Lực tạo gel (Gel strength) và độ cứng (Hardness).
Tiến hành đo tính lưu biến của hạt để xác định các tính chất của hạt vi nang tạo thành sau khi mới lọc rửa xong để ráo nước từ các mẫu hạt tạo trong các điều kiện đông tụ khác nhau (nồng độ kiềm, loại kiềm). Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
a. Lực tạo gel
Kết quả khảo sát lực tạo gel được thể hiện trong Hình 3.4.
Hình 3.4. Lực tạo gel của hạt tại các điều kiện đông tụ khác nhau. (A) Tween80; (B) Span80
Thảo luận:
Theo kết quả thể hiện trong Hình 3.4, lực tạo gel dao động trong khoảng 0,0131 – 0,0135 (N) và không có sự khác biệt giữa các điều kiện đông tụ (loại kiềm, nồng độ kiền, chất nhũ hóa). Kết quả nghiên cứu trước đó cho thấy, khi theo dõi khối lượng hạt cũng như pH của môi trường tạo hạt theo thời gian, khối lượng hạt và pH giảm nhanh trong khoảng 10 phút đầu và đạt tới cân bằng sau 30 phút đối với dải nồng độ kiềm trong khoảng từ 0.5M – 2.0M. Như vậy, hạt tạo thành sau 60 phút đã đạt tới trạng thái cân bằng và không thay đổi về tính chất.
b. Độ cứng
Kết quả khảo sát độ cứng của hạt được thể hiện trong Hình 3.5.
Hình 3.5. Độ cứng của hạt tại các điều kiện đông tụ khác nhau. (A) Tween80; (B) Span80
Thảo luận:
Kết quả xác định độ cứng của hạt tương đồng với kết quả xác định lực tạo gel. Khi thay đổi điều kiện đông tụ bao gồm loại kiềm, nồng độ kiềm và chất nhũ hóa, hạt tạo ra có độ cứng như nhau, nằm trong khoảng từ 0,013 – 0,016 (MPa).
3.3. Ảnh hưởng của điệu kiện đông tụ tới kích thước và hình dạng hạt.
Chúng tôi sử dụng phần mềm ImageJ 14.6 để phân tích phân bố kích thước hạt cũng như hình dạng của hạt dựa trên 3 thông số: diện tích, độ tròn, tính bề mặt. Kết quả được thể hiện trong các hình sau.
3.3.1.Ảnh hưởng của điều kiện đông tụ tới kích thước hạt
Phân bố kích thước của hạt được xác định thông qua phân bố diện tích hạt. Kết quả thể hiện trong Hình 3.6.
Hình 3.6. Phân bố hạt theo diện tích ở các điều kiện đông tụ khác nhau. (A) KOH; (B) NaOH.
Bảng 3.1. Giá trị Mode của phân bố diện tích hạt nồng độ kiềm (mm2)
Nồng độ kiềm (M) Dung dịch
kiềm 0.5 1.0 1.5 2.0 KOH 0.091 0.091 0.083 0.115 NaOH 0.093 0.087 0.096 0.101
Bảng 3.2. Giá trị Median của phân bố diện tích hạt theo nồng độ kiềm (mm2) Nồng độ kiềm (M) Dung dịch kiềm 0.5 1.0 1.5 2.0 KOH 0.089 0.090 0.086 0.112 NaOH 0.084 0.089 0.092 0.112 Thảo luận:
Phổ phân bố kích thước hạt đông tụ trong NaOH và trong KOH là đồng dạng với nhau và với các nồng độ khảo sát. Phổ phân bố kích thước hạt tạo thành theo phương pháp này rất tập trung (giá trị CV% < 10). Đối với nồng độ 0.5M, mức độ tập trung của hạt cao hơn so với 3 nồng độ còn lại (CV% ~ 5 – 6%).
Giá trị Mode và Median của các mẫu khảo sát tương đối tập trung và nằm trong khoảng 0.083 – 0.115 (mm2), tương ứng với đường kính hạt từ 325 - 383 (µm). Nếu chỉ xem xét giá trị Mode, sự ảnh hưởng của nồng độ kiềm tới kích thước hạt không được thể hiện rõ rệt. Tuy nhiên, khi quan sát đồ thị tỷ lệ tích lũy trong Hình 3.6, chúng tôi nhận thấy có sự thay đổi về giá trị Median giữa các nồng độ kiềm khác nhau. Đối với mẫu NaOH, giá trị Median tăng dần theo nồng độ NaOH sử dụng. Đối với mẫu KOH, giá trị Median tại 3 nồng độ 0.5M; 1.0M và 1.5M không có sự khác biệt rõ rệt trong khi tại nồng độ 2.0M giá trị này tăng vọt. Ta có thể dễ dàng quan sát thấy điều này trên đồ thị Hình 3.6, đường thể hiện tỷ lệ tích lũy của mẫu KOH 2.0M nằm tách hẳn so với đồ thị thể hiện tỷ lệ tích lũy của 3 nồng độ còn lại.
Điều này có thể giải thích dựa trên tốc độ khuếch tán và tốc độ đông tụ khác