mẫu cá bệnh
Nhân tố môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cá. Nếu môi trường thay đổi theo hướng bất lợi sẽ làm cho cá bị yếu đi và trở thành yếu tố trực tiếp gây bệnh hoặc tạo cơ hội cho tác nhân gây bệnh khác phát huy hiệu quả gây bệnh trên cá. Việc phân tích các thông số môi trường nước ở thời điểm cá bị bệnh là rất quan trọng và là cơ sở để xác định tác nhân gây bệnh chính cho cá.
3.1.1. Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý nước tại vùng nuôi
Cùng với việc thu mẫu cá bệnh, mẫu nước vùng nuôi cá cũng được thu và đem về phòng thí nghiệm để phân tích các chỉ tiêu hóa lý cần thiết. Kết quả phân tích cho thấy, các yếu tố như nhiệt độ nước, pH, độ mặn, độ kiềm, oxy hòa tan (DO), nhu cầu oxy hóa học (COD), nhu cầu oxy sinh hóa (BOD), amonia (NH4+-N), nitrate (NO3--N), nitrite (NO2--N) đều nằm trong giới hạn cho phép đối với nước nuôi trồng thủy sản. Chỉ riêng có nồng độ Sulfide (S2-) và phosphate (PO43--P) có vượt giới hạn nhưng không nhiều. Cụ thể, đối với sulfide (S2-) đo ở các đợt 2 (0,007 mg/l) và 4 (0,006 mg/l) vượt quá giới hạn cho phép là 0,005mg/l, phosphate (PO43-- P) trong các đợt đo luôn ở mức bằng hoặc cao hơn so với tiêu chuẩn cho phép, nhưng cao hơn không nhiều, cao nhất là đợt phân tích mẫu thứ 5 (0,020 mg/l).
Theo Sena S. De Silva (1998), đối với môi trường nuôi cá chẽm, giới hạn cho phép đối với H2S là <0,3 mg/l, điều kiện tối ưu để cá phát triển tốt là 0 mg/l; nhiệt độ tối ưu: 26 - 320C (giới hạn >150C); độ mặn: 0 - 35%o; pH tối ưu từ 7,5 - 8,5 (giới hạn >4); amonia (NH4+-N) tối ưu là 0 mg/l (giới hạn <0,46 mg/l); oxy hòa tan (DO) tối ưu từ 4 - 9 mg/l (giới hạn >1 mg/l)[64]. Cũng theo một tài liệu khác là “sinh học và kỹ thuật nuôi cá chẽm” của Khoa Thủy sản - Đại học Cần Thơ (1994) thì vị trí chọn vùng nuôi thích hợp cho cá chẽm là ở môi trường nước có: pH từ 7,5 - 8,5; oxy hòa tan nằm trong khoảng 4 - 9 mg/l; độ mặn 10 - 30%; nhiệt độ từ 26 - 320C;
Như vậy, trong các yếu tố môi trường nước đã phân tích thì đa số đều nằm trong giới hạn cho phép để nuôi cá chẽm. Riêng chỉ có chỉ tiêu sulfide (S2-) và phosphate (PO43--P) có vượt giới hạn không đáng kể so với các tiêu chuẩn hiện hành đối với môi trường nước nuôi trồng thủy sản nói chung, nhưng vẫn nằm trong giới hạn cho phép so với các tài liệu chuyên môn về nuôi cá chẽm. Từ kết quả này đề tài nhận thấy, các yếu tố môi trường nước cơ bản đã phân tích đều không ảnh hưởng xấu đến cá, nguyên nhân gây bệnh lở loét cho cá có thể đến từ một tác nhân hữu sinh khác.
Kết quả cụ thể các chỉ tiêu hóa lý nước nuôi thu tại thời điểm cá chẽm bị bệnh lở loét được thể hiện qua bảng 3.1 sau.
3.1.2. Kết quả định lượng vi khuẩn Vibrio tổng số và vi khẩn hiếu khí tổng số trong nước tại vùng nuôi
Vibrio được báo cáo là giống vi khuẩn gây bệnh trên các đối tượng nuôi thủy sản nước mặn nhiều nhất. Vì vậy, việc định lượng Vibrio tổng số và vi khuẩn hiếu khí tổng số trong nước nuôi sẽ góp phần đánh giá chất lượng nước nuôi, đồng thời là cơ sở để xác định khả năng gây bệnh cá từ nhóm tác nhân này. Vibrio tổng số được định lượng trên môi
Chỉ tiêu\đợt Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 Đợt 4 Đợt 5 Mức tiêu chuẩn cho phép pH 7,9 8,0 7,8 7,8 8,0 o\ V i 1 T0 nước (0C) 28 29 27 28 28 < 30* Độ mặn (%o) 32 33 33 32 32 - Độ kiềm (mg/l) 92 98 100 94 98 60-180 DO (mg/l) 5,15 5,20 5,22 5,55 5,30 > 5* COD (mg/l) 1,12 1,34 1,96 2,50 1,16 < 3* BOD (mg/l) 0,87 0,28 1,10 1,34 0,52 < 10** NH4+- N(mg/l) 0,012 0,023 0,035 0,023 0,030 < 0,1* NO2--N (mg/l) <0,005 <0,005 <0,005 <0,005 0,005 <0,055*** NO3--N (mg/l) 0,042 0,056 0,045 0,060 0,049 < 0,07*** S2- (mg/l) 0,003 0,007 0,005 0,006 0,004 < 0,005* PO43--P (mg/l) 0,015 0,016 0,016 0,018 0,020 < 0,015***
Ghi chú: “-”, không quy định; *, áp dụng theo QCVN10: 2008/BTNMT-12]; **, áp dụng theo TCVN 5943 - 1995[21]; ***, Áp dụng theo tiêu chuẩn Asean về chất lượng nước biển bảo vệ đời sống thủy sinh[75].
nuôi dao động từ 60 - 320 CFU/ml, kết quả phân tích này cao hơn so với các nghiên cứu trước đây về số lượng Vibrio trong nước biển ở một số khu vực nuôi trồng thủy sản. Theo Võ Hải Thi và ctv (2001), ở khu vực cửa sông Cái và sông Bé - Nha Trang - Khánh Hòa, số lượng Vibrio dao động từ 24 - 54 tế bào/ml (vào mùa mưa) và 3 - 50 tế bào/ml (mùa khô)[16]. Theo Nguyễn Hữu Thọ và ctv (2009, 2010), ở khu vực Vũng Ngán - Nha Trang - Khánh Hòa, mật độ vi khuẩn Vibrio tổng số dao động trong khoảng từ 10 - 140 CFU/ml
[18],[19]. Võ Hải Thi và ctv (2003), khi nghiên cứu về biến động số lượng Vibrio theo mùa trong các khu vực nuôi tôm tại 2 tỉnh Cà Mau và Trà Vinh cho thấy, mật độ Vibrio trong nước khu vực nuôi tôm ở 2 tỉnh này dao động động từ 1 - 178 tế bào/ml[17]. Một nghiên cứu khác của Nguyễn Hữu Huân và ctv (2006), Vibrio tổng số tại đầm Thị Nại (Bình Định) dao động từ 1 - 5 tế bào/ml (vào mùa khô) và 2 - 48 tế bào/ml (vào mùa mưa)[7].
+Kết quả định lượng vi khuẩn hiếu khí tổng số: Vi khuẩn hiếu khí tổng số qua các đợt thu mẫu dao động từ 800 - 1520 CFU/ml, kết quả nghiên cứu này cao hơn so với các nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thọ và ctv (năm 2008, 2009) tại cùng khu vực Vũng Ngán. Bởi theo báo cáo nhiệm vụ quan trắc thường xuyên của Nguyễn Hữu Thọ và ctv tại khu vực Vũng Ngán, mật độ vi khuẩn hiếu khí dao động từ 360 - 1270 CFU/ml (năm 2008) và 110 - 840 CFU/ml (năm 2009) [18]’ [19].
so với các nghiên cứu trước đây [cao hơn gấp khoảng 6 lần so với nghiên cứu của Võ Hải Thi và ctv (2001) và gấp hơn 2 lần so với nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thọ và ctv (năm 2008, 2009)]. Qua kết quả phân tích này, đề tài nhận thấy vi khuẩn thuộc giống Vibrio có khả năng là nguyên nhân gây bệnh lở loét cho cá.
Biểu đồ 3.1. Vi khuẩn hiếu khí tổng số và Vibrio tổng số trong nước nuôi cá chẽm qua các đợt thu mẫu.
□ Vibrio tổng số
□ Vi khuẩn HK
tổng số
Từ 19 mẫu cá chẽm bị bệnh, đề tài đã phân lập được 6 loài vi khuẩn. Bằng việc thực hiện các phản ứng sinh hóa theo bộ kit định danh API 20E, định danh theo phần mềm định danh API 20E của hãng Biomerieux (Pháp) kết hợp với tài liệu định danh vi khuẩn “Bergey’s manual of determinative bacteriology” của Jonhn G. Holt và ctv (1994)[40], đề tài đã xác định cấp độ loài của 6 chủng vi khuẩn phân lập được như sau:
Vibrio alginolyticus: Gram (-), hình que ngắn, di động, trên môi trường TCBS
khuẩn lạc có màu vàng, bờ không đều. Trên môi trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang. Có thể phát triển tốt ở các nồng độ muối 3, 7, 10%, nhưng không mọc được trong môi trường muối 0%, nhạy với vibriostat 0/129, oxidase (+), catalase (+), ONPG (-)....
« I I I
Í-4U*MAN ao*.**»— • im H
Hình 3.1. Hình thái vi khuẩn V. alginolyticus trên môi trường TCBS và đặc điểm sinh hóa trên test kít API - 20E.
phát triển được ở nồng độ muối 0 và 10%, nhạy với vibriostat 0/129, oxidase (+), catalase (+), ONPG (-)...
Vibrio anguillarum: Gram (-), hình que, trên môi trường TCBS khuẩn lạc có
màu vàng, oxidase (+), catalase (+), ONPG (+), phát triển tốt ở muôi trường có nồng độ muối 3 và 7%, không phát triển trong muôi trường 0 và 10% muối, nhạy với vibriostat 0/129.
Vibro vulnificus: Gram (-), hình que, trên môi trường TCBS có màu xanh, oxidase (+), catalase (+), ONPG (+), phát triển tốt trong môi trường có nồng độ muối 3 và 7%, không phát triển trong môi trường có nồng độ muối 0% và 10%...
Photobacterium damselae: Gram (-), hình que ngắn, không di động, khuẩn lạc
trên môi trường TSA lồi, bờ đều, có màu trắng, oxidase (+), manitol (-)...
Pseudomonas sp.: Gram (-), hình que dài, di động. Trên môi trường CA khuẩn
lạc có dạng tròn, lồi, trắng sữa. Thử nghiệm catalase (+), oxidase (+),...
Đặc điểm sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập được từ cá chẽm bị bệnh lở loét được mô tả cụ thể qua bảng 3.2.
o ET a* § eg 3' ET f 5' > s C/5 2 % g 2 o O < g H c ffi o O r > Q O & O ft»o P' 3 ° a. o- P o O o £ ►c r > O o £ & O 1 S m r 13 O £ <3 G£¡ H o o O o o ►13 O 3 3 O' P o C at al as e Vibrio alginolyticus Vibrio parahaemolyticus Vibrio anguillarum Vibrio vulnificus Photobacterium damselae Pseudomonas sp. Ban g 3.2. Các dác diém sink hóa cúa các chúng vi khuán phán láp duac tu cá chem bi bénh la loét.
Ten loái vi khuán dé nghi
+Tần số bắt gặp các loài vi khuẩn trên cá chẽm bị bệnh lở loét
Trong 6 loài vi khuẩn phân lập được thì Vibrio alginolyticus có tần số bắt gặp (TSBG) cao nhất là 100% (19/19 trường hợp), và cũng là loài có số lượng khuẩn lạc xuất hiện nhiều nhất khi cấy trên các môi trường TSA và TCBS. Đồng thời cũng bắt gặp trên tất cả các cơ quan phân tích (gan, thận, vết loét). Các loài vi khuẩn còn lại là V. parahaemolyticus, V. anguillarum, V. vulnificus, Photobacterium damselae và
Pseudomonas sp. đều phân lập được ở vết loét. Ở gan phân lập được loài V. parahaemolyticus, Photobacterium damselae và Pseudomonas sp.. Trên thận không phân
lập được loài nào khác ngoài
V.
anginolyticus.
Kết quả được biểu diễn qua biểu đồ 3.2. o ặ 05 H 4* «V
Biểu đồ 3.2. Tần số bắt gặp của các loài vi khuẩn phân lập được
từ cá chẽm bị bênh lở loét. □ G a n □ T h ậ n □ V ế t l o é t □ C h u n g ■ỷ ỷ<£ ■ Loài vi khuẩn & r & & 4^
Vibrio alginolyticus: Xuất hiện ở tất cả các cơ quan phân tích. Theo mô tả của Colorni và ctv (1981), Austin và ctv (1993) (trích dẫn bởi Austin B. và ctv, 2007), bệnh do
V. alginolyticus gây ra có thể được liệt vào dạng bệnh vi khuẩn nhiễm trùng máu. Cá bị
nhiễm bệnh thường trở nên chậm chạp, da trở nên xám đen, vảy bong và tróc, phát triển thành dạng lở loét. Gan, mao mạch trong da, bóng bơi, màng bụng trở nên sung huyết, ruột sưng phồng có dịch lỏng, biểu hiện thiếu máuvà mang bị thối rữa cũng đã được báo cáo. Các nghiên cứu của Woo và ctv (1995), Ye và ctv (1997) (trích dẫn bởi Austin B. và ctv, 2007) cho rằng V. alginolyticus là tác nhân gây chết nhiều ở cá tráp bạc (Sparus sarba) tại
Hong Kong[29]. Một nghiên cứu khác của Balebona M. Carmen (1998) trên cá tráp đầu bạc
(Sparusaurata L.) nuôi ở Tây Ban Nha cũng cho thấy V. alginolyticus là tác nhân chính
gây bệnh với LD50 từ 5,4 x 104 - 1 x 106 CFU/g cơ thể. Các dấu hiệu bệnh đặc trưng gây nên bởi tác nhân này như nhiễm trùng máu xuất huyết, cơ thể trở nên xám đen, một số trường hợp xuất hiện lở loét trên cơ thể, tích dịch ở màng bụng, gan xuất huyết[30]. Theo FAO, V. alginolyticus là tác nhân gây bệnh vi khuẩn da trên cá chẽm[36]. Theo Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv (2008), trên cá mú bị lở loét cũng bắt gặp loài vi khuẩn V. alginolyticus với TSBG là 50%[20].
Vibrio anguillarum: TSBG trên vết loét là 15,7%, không bắt gặp ở gan và thận.
Theo các nghiên cứu trước đây thì V. anguillarum là loài vi khuẩn gây nên bệnh “Red- prest” làm mất mùa lớn ở cá chình nuôi biển Italia từ khoảng thế kỷ 18 - 19[29]. Đến nay, V. anguillarum đã được báo cáo là tác nhân chính gây bệnh trên các đối tượng như cá bơn
giai đoạn ấu niên ở miền Bắc Trung Quốc làm cá chết lên tới 90 -100% (Lei và ctv, 2006) (trích dẫn bởi Austin B. và ctv, 2007)[29]. Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2008) thì V. anguillarum là tác nhân chính gây nên bệnh “Vibriosis” trên các loài cá nuôi biển ở Khánh
Hòa, V. anguillarum đã gây bệnh trong điều kiện thí nghiệm (60 - 80%), liều tiêm 0,3 ml
huyền dịch có mật độ vi khuẩn 4 x 106 - 4 x 107 tbvk/ml sau 3 ngày thử thách[5].
Vibrio parahaemolyticus: TSBG trên vết loét là 26,3%, trên gan là 5,2%, không
bắt gặp ở thận. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv (2008) cho thấy V. parahaemolyticus là tác nhân gây nên bệnh lở loét ở cá mú tại Khánh Hòa với TSBG là
Vibrio vulnificus: TSBG trên vết loét là 10,5%, không bắt gặp ở gan và thận. Theo
các nghiên cứu trước đây, từ năm 1975 đến 1977, ở Nhật Bản có sự bùng nổ của bệnh ở cá chình nuôi tại 6 vùng khác nhau. Bệnh sau đó phổ biến ở các nước châu Âu là Tây Ban Nha, Hà Lan và Anh. Vi khuẩn gây nên các vết đỏ trên cơ thể, làm xuất huyết ở bên sườn và đuôi. Trong trường hợp nặng hơn, bệnh có thể thay đổi và xuất hiện trong ống ruột, mang, tim, gan và thận. Ở bên ngoài, dấu hiệu bệnh giống như bệnh vibriosis. Trong năm 2005, bệnh được ghi nhận là nguyên nhân gây chết nhiều ở cá nục hình trứng (Trachinotus ovatus) ở Trung Quốc, với các dấu hiệu bệnh bao gồm xuất huyết và lở loét bên ngoài và
mang, ruột và gan cũng bị xuất huyết. Một type mới là V. vulnificus biotype 2 serova A
được ghi nhận ở Tây Ban Nha từ năm 2000 và Đan Mạch năm 2004 gây bệnh trên cá chình từ 5 - 10g làm hoại tử và xuất huyết[29].
Photobacterium damselae: TSBG trên vết loét là 15,7% và trên gan là 5,2%, không
bắt gặp ở thận. Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy loài Photobacterium damselae
gồm 2 loài phụ thường gây bệnh trên cá là Photobacterium damselae subsp. damselae và
Photobacterium damselae subsp. piscicida. Trong đó, Photobacterium damselae subsp.
damselae gây bệnh lở loét dọc sườn ở loài cá thia Chronis punctipinis vào mùa hè và mùa
thu ở vùng Nam California. Ngoài ra, loài này cũng được báo cáo là gây bệnh trên cá mập, cá bơn và cá trác sọc vàng. Đặc điểm của bệnh là tổn thương da, làm lở loét đặc biệt ở vùng vây ức và cuống đuôi. Vết loét có thể có đường kính rộng 5 - 20mm[29]. Đối với
Photobacterium damselae subsp. piscicida, bệnh do vi khuẩn này gây ra được báo cáo từ
năm 1970 bởi Lewis và ctv (trích dẫn bởi Austin B. và ctv, 2007) khi gây bệnh ở cá mòi dầu và cá sộp ở vịnh Galveston, Texas. Egusa (1983) báo cáo vi khuẩn này gây bệnh trên cá yellowtail ở Nhật Bản, sau đó được báo cáo gây bệnh trên các đối tượng như cá tráp vàng, cá tráp đỏ, cá tráp đen[29].
Pseudomonas sp.: TSBG trên vết loét là 15,7%, trên gan 5,2%, không bắt gặp ở thận. Giống Pseudomonas thường gặp các loài gây bệnh cho cá như: P. anguilliseptica
thường gây bệnh ở cá trích Baltic (Clupea harengus membras), cá tráp đầu bạc, cá tráp
chấm đen, cá mú chấm cam...[29]; P. plecoglosicida: gây bệnh trên cá ayu (Plecoglossus altivelis) ở Nhật Bản; P. putida: gây lồi mắt và lở loét trên cá hồi nuôi hồ ở Thổ Nhĩ Kỳ[29],
Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv (2008) cũng phân
lập được vi khuấn Pseudomonas sp. trên cá mú bị bệnh lở loét, tuy nhiên tần số bắt gặp không
nhiều[20].
Từ kết quả trên ta thấy, V. alginolyticus là loài có TSBG cao nhất 100% (19/19)
trong khi đó các loài vi khuấn khác có TSBG thấp hơn nhiều [Vibrio anguillarum (15,7%),
Vibrio parahaemolytic (26,3%), Vibrio vulnificus (10,5%), Photobacterium damselae
(15,7%), Pseudomonas sp (15,7%)] nên có khả năng V. alginolyticus là tác nhân gây bệnh
chính làm cho cá bị lở loét, còn các loài vi khuấn khác có thể chỉ là tác nhân cơ hội. 3.2.2. Kết quả phân lập nấm trên cá chẽm bị bệnh lở loét
Mẫu vết loét và mang được cấy vào môi trường SA, nuôi cấy ở 28 - 300C/3 - 5 ngày. Trong 19 mẫu cá chỉ một lần xuất hiện nấm ở mang với các đặc điểm sợi nấm màu trắng, có vách ngăn, đính bào tử hình tròn chứa các bào tử nhỏ, tròn, có màu đen.... Dựa vào các tài liệu, đề tài đề nghị đây là nấm thuộc giống Aspergillus, với tần số bắt gặp là 1/19 (5,3%). Hình thái khuấn ty, đính bào tử, cuống bào tử được thể hiện qua hình 3.4.