3. NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Nội dung nghiên cứu
3.2.4.5. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Mổ khám lấy miếng ruột ở vùng ruột bị viêm ngâm trong dung dịch formon 10% để làm tiêu bản tổ chức học vi thể.
Cách làm tiêu bản: Ruột lợn mắc bệnh được cố định bằng dung dịch formon 10% (thể tích formon gấp 10-20 lần thể tích tổ chức ruột).
- Tẩy làm trong:
+ Lấy bệnh phẩm ra khỏi dung dịch formon 10% rồi đem rửa nước từ 12-24 giờ (rửa dưới vòi nước chảy nhẹ) để trôi hết formon.
+ Khử nước: mẫu bệnh phẩm rửa nước xong thấm nhẹ trên giấy lọc rồi cho vào hệ thống cồn Ethylic với thời gian như sau: Cốc 1 là cồn 700 với thời gian 2-4 giờ, cốc 2,3,4 là cồn 1000 với thời gian 4-6 giờ. Thời gian có thể thay đổi tùy mẫu tổ chức to hay nhỏ.
+ Làm trong: Lấy 3 miếng tổ chức ra khỏi cồn, thấm nẹ trên giấy lọc rồi cho vào hệ thống 3 lọ Xylen, mỗi lọ 2 giờ. Thời gian có thể thay đổi tùy tlợn miếng tổ chức to hay nhỏ. Sau khi đi qua lần lượt 3 lọ Xylen, miếng tổ chức trong như đường phèn là được, nếu không phải khử lại từ cồn tuyệt đối rồi lại đưa vào dung dịch làm trong.
- Tẩm parafin gồm: Cốc 1: parafin + Xylen theo tỷ lệ 1:1 từ 2-12 giờ ở 370C, sau đó lần lượt cho qua 3 cốc parafin ở nhiệt độ 560C mỗi cốc 4-6 giờ. (Khi tẩm cần tlợn dõi nhiệt độ liên tục, nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp miếng tổ chức sẽ bị hỏng).
- Đổ Block: Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, khuôn giấy, parafin phải nóng chảy hoàn toàn nhưng nhiệt độ không được quá cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng tiêu bản sau này. Đợi cho parafin đông đặc hoàn toàn, bóc bỏ khuôn giấy và sửa lại Block cho vuông vắn.
- Cắt dán mảnh: Cắt miếng tổ chức trên máy cắt Microtom với độ dày 3mm. Mảnh tổ chức khi được cắt ra sẽ được để tãi phẳng nhờ nước trứng trên ngọn lửa đèn cồn. Để miếng tổ chức khô nhờ không khí sau một thời gian thì cho vào tủ ấm 370C.
- Nhuộm tiêu bản:
+ Tẩy parafin: Cho tiêu bản lần lượt qua 3 lọ Xylen mỗi lọ 3-5 phút. Khi cho tiêu bản qua Xylen phải thường xuyên nhấc lên nhấc xuống cho tan parafin xung quanh miếng tổ chức.
+ Tẩy Xylen: Dùng cồn Ethylic, cốc 1 dùng cồn 960 từ 3-5 phút; cốc 2,3 dùng cồn 1000 từ 3-5 phút.
+ Nhuộm Hematoxylin: Ngâm tiêu bản trong dung dịch Hematoxylin khoảng 5- 10 phút tùy theo chất lượng thuốc nhuộm và độ dày tiêu bản. Sau khi nhuộm
Hematoxylin phải kiểm tra, nếu màu tiêu bản nhạt có thể nhúng nhanh tiêu bản qua cồn Axit chlohydric. Sau khi điều chỉnh màu rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin: Cho tiêu bản vào Eosin khoảng 30 giây-2 phút tùy theo thực tế, nếu màu Eosin nhạt có thể cho vào dung dịch Eosin 1-2 giọt axit axetic. Sau đó rửa bằng nước cất 1-2 phút.
+ Tẩy nước: Dùng cồn Ethylic tẩy nước trong tiêu bản. Cốc 1 dùng cồn 900 trong 2-3 phút; cốc 2,3 dùng cồn 1000 trong 3-5 phút.
+ Làm trong: Cho tiêu bản qua 2 cốc Xylen mỗi cốc 3-5 phút. - Gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả trên kính hiển vi.