Nguồn nấm Bipolaris sp. và Pithomyces sp. nhận từ bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Các loại thuốc và dịch tr ch thực vật dùng trong th nghiệm: Comcat 150WP, Kasumin 2L, Tilt super 300EC, Help 400SC, cỏ hôi, lá neem, củ nghệ và lá sống đời (Bảng 2.1).
Bảng 2.1 N ng độ các l ại thuốc và ịch t ích thực vật được ng t ng các thí nghiệm.
STT Tên thuốc ịch t ích thực vật N ng độ N ng độ 1 (1 2 khuyến cá ) N ng độ 2 (khuyến cá ) N ng độ (gấp đôi khuyến cáo)
1 Tilt super 300EC 46,900 µl/100 ml 93,800 µl/100 ml 187,600 µl/100 ml
2 Comcat 150WP 0,016 g/100 ml 0,032 g/100 ml 0,064 g/100 ml 3 Help 400SC 46,900 µl/100 ml 93,800 µl/100 ml 187,600 µl/100 ml 4 Kasumin 2L 140,500 µl/100 ml 281,000 µl/100 ml 562,000 µl/100 ml 5 Lá neem 2% 4% 8% 6 Cây cỏ hôi 2% 4% 8% 7 Lá sống đời 2% 4% 8% 8 Củ nghệ 2% 4% 8% 2.1.3. Các ng c thí nghiệm
Đ a petri, beaker, ue cấy, tủ úm, tủ thanh trùng ướt, tủ thanh trùng khô, k nh hiển vi, micropipet, đèn cồn, đũa cấy, kim mũi giáo, ống đục tròn, kẹp, hóa chất…
2.1.4. Công thức môi t ường PDA được ùng t ng thí nghiệm
Khoai tây 200 gram Đường Dextrose 20 gram Agar 20 gram Nước cất 1000 m
14
pH 6,5 – 6,8
2.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
2.2.1 Thí nghiệm 1. khả át hiệu uả của ốn l ại thuốc h a học đối với nấm
Bipolaris sp.và Pithomyces p. gây l m l p hạt lúa t ng điều kiện in vitro
M c đích: đánh giá hiệu uả của các loại thuốc hóa học đối với hai loại nấm
Bipolaris sp. và Pithomyces sp. gây lem l p hạt lúa.
Th nghiệm được bố tr theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 13 nghiệm thức. Trong đó có 12 nghiệm thức sử dụng thuốc hóa học và 1 nghiệm thức đối chứng (cho một loại nấm), mỗi nghiệm thức có 5 lần l p lại. Loại thuốc và nồng độ thuốc được trình bày trong Bảng 2.1. Nghiệm thức đối chứng là môi trường PDA không có chứa thuốc hóa học.
Chuẩn bị nguồn nấm Bipolaris sp. và Pithomyces sp.: nấm được nuôi cấy trong môi trường PDA khoảng 10 ngày trước khi tiến hành th nghiệm. Khuẩn ty nấm sẽ được đục thành các khoanh có đường k nh 5 mm khi thực hiện th nghiệm.
Các loại thuốc hóa học được t nh toán liều lượng sao cho khi hòa tan vào chai thủy tinh chứa 100 ml môi trường PDA sẽ đạt được nồng độ đã định s n. Nấu tan môi trường PDA. Khi chai môi trường đạt nhiệt độ khoảng 55-60oC (có thể cầm được chai môi trường bằng tay) thì đưa lượng thuốc hóa học đã chuẩn bị vào chai, lắc chai môi trường để thuốc hòa tan đều vào môi trường. Sau đó, chiết 10 ml môi trường đã pha thuốc vào mỗi đ a petri. Khi môi trường đ c lại, đ t các khoanh khuẩn ty nấm đã chuẩn bị vào giữa đ a petri (Hình 2.1).
H nh 2.1 Sơ đ ố t í th nghiệm hiệu uả của thuốc h a học đối với nấm Bipolaris sp. và
Pithomyces p. gây l m l p hạt lúa.
Khoanh khuẩn ty nấm gây bệnh lem lép hạt (đường kính khoanh khuẩn ty 5 mm)
Môi trường (10 ml) đã có thuốc hóa học theo nồng độ tính s n
15
Ch tiêu ghi nhận ghi nhận đường k nh khuẩn ty nấm (ĐKKT) vào các thời điểm 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 GSTN (giờ sau thử nghiệm).
Hiệu uả của thuốc được t nh theo công thức Abbot (1925): (ĐKKTđc – ĐKKTi)
HQT(%) = x 100 ĐKKTđc
Trong đó: ĐKKTđc: Đường k nh khuẩn ty của nghiệm thức đối chứng ĐKKTi: Đường k nh khuẩn ty của nghiệm thức thuốc i Số liệu thống kê được xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC.
2.2.2 Thí nghiệm 2. khả át hiệu uả của ốn l ại ịch t ích thực vật đối với nấm Bipolaris sp.và Pithomyces sp. gây l m l p hạt lúa t ng điều kiện in vitro
M c đích: đánh giá hiệu uả của các loại dịch tr ch thực vật đối với hai loại
nấm Bipolaris sp. và Pithomyces sp. gây lem l p hạt lúa.
Th nghiệm được bố tr theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 13 nghiệm thức. Trong đó 12 nghiệm thức sử dụng dịch tr ch thực vật và 1 nghiệm thức đối chứng (cho một loại nấm), mỗi nghiệm thức có 5 lần l p lại. Loại dịch tr ch thực vật và nồng độ dịch tr ch được trình bày trong Bảng 2.1. Nghiệm thức đối chứng là môi trường PDA không có chứa dịch tr ch thực vật.
Chuẩn bị nguồn nấm Bipolaris sp. và Pithomyces sp. được thực hiện tương tự Th nghiệm 1.
Các loại dịch tr ch thực vật được t nh toán khối lượng sao cho khi hòa tan vào chai thủy tinh chứa môi trường PDA sẽ đạt được nồng độ đã định s n với tổng thể t ch là 100 ml. Các loại thực vật được thu lúc 8 giờ sáng, sau khi thu về chọn lấy những bộ phận trưởng thành (lá cỏ hôi, lá neem, lá sống đời và củ nghệ), rửa sạch đất cát, để ráo và được tr ch với nước cất bằng cách t nh nồng độ trọng lượng lá tươi/thể t ch. Sau đó, xay nhuyễn bằng máy xay sinh tố, lượt lấy phần dịch tr ch và lọc ua dụng cụ lọc vi khuẩn Syringe có đường k nh 0,2 µm để loại vi khuẩn.
Nấu tan môi trường PDA. Khi chai môi trường đạt nhiệt độ khoảng 55-60oC (có thể cầm được chai môi trường bằng tay) thì đưa dịch tr ch thực vật đã được t nh s n nồng độ từ nồng độ gốc cho vào chai môi trường PDA sao cho tổng thể t ch là 100 ml, lắc chai môi trường để dịch tr ch hòa tan đều vào môi trường. Sau đó, cho vào mỗi đ a petri 10 ml môi trường PDA. Khi môi trường đ c lại, đ t các khoanh khuẩn ty nấm đã chuẩn bị vào ch nh giữa đ a petri (Hình 2.2).
16
H nh 2.2 Sơ đ ố t í th nghiệm hiệu uả của ịch t ích thực vật đối với nấm Bipolaris sp. và Pithomyces p. gây l m l p hạt lúa
Ch tiêu ghi nhận ghi nhận đường k nh khuẩn ty nấm vào các thời điểm 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 GSTN.
Hiệu uả của thuốc được t nh theo công thức Abbot (1925): (ĐKKTđc – ĐKKTi)
HQT(%) = x 100 ĐKKTđc
Trong đó: ĐKKTđc: Đường k nh khuẩn ty của nghiệm thức đối chứng ĐKKTi: Đường k nh khuẩn ty của nghiệm thức dịch tr ch thứ i Số liệu thống kê được xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC.
Khoanh khuẩn ty nấm gây bệnh lem lép hạt (đường kính khoanh khuẩn ty 5 mm)
Môi trường (10 ml) đã có dịch tr ch thực vật theo nồng độ tính s n
17
CHƯƠNG
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. HIỆU QUẢ ĐỐI KHÁNG CỦA BỐN LOẠI THUỐC HÓA HỌC ĐỐI VỚI SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM BIPOLARIS SP. VÀ PITHOMYCES SP. GÂY BỆNH LEM LÉP HẠT LÚA TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO
3.1.1 Hiệu quả đối kháng của 4 loại thuốc hóa học đối với sự phát triển của nấm Bipolaris sp. gây bệnh lem lép hạt lúa trong điều kiện in vitro
Đường kính khuẩn ty nấm Bipolaris sp. ở các nghiệm thức xử lý Tilt super 300EC, Help 400SC, Kasumin 2L và Comcat 150WP vào các thời 48, 72, 96, 120, 144 và 168 GSTN (giờ sau thử nghiệm) được ghi nhận ở Bảng 3.1. Kết uả cho thấy ngoại trừ các nghiệm thức xử lý Comcat 150WP thì các nghiệm thức còn lại (ở cả ba nồng độ khảo sát) đều cho hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty của nấm
Bipolaris sp. và khác biệt có ý ngh a so với đối chứng ở tất cả các thời điểm uan
sát. Ở thời điểm 48 GSTN, ĐKKT của các nghiệm thức xử lý Tilt super 300EC, Help 400SC và Kasumin 2L dao động trong khoảng 0,5 cm đến 1,3 cm; thấp hơn có ý ngh a so với nghiệm thức đối chứng (2,0 cm) và các nghiệm thức xử lý Comcat 150WP (2,4 đến 2,7 cm). Ở các thời điểm 72, 96, 120, 144 và 168 GSTN, các nghiệm thức xử lý Tilt super 300EC, Help 400SC và Kasumin 2L cũng cho hiệu quả tương tự. Tại thời điểm ghi nhận cuối cùng (168 GSTN), các nghiệm thức xử lý Tilt super 300EC có ĐKKT nhỏ (khoảng 0,6 đến 1,6 cm), kế đến là các nghiệm thức xử lý Kasumin 2L (khoảng 1,4 đến 2,2 cm) và cuối cùng là các nghiệm thức xử lý Help 400SC (1,9 đến 2,1 cm).
18
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của bốn loại thuốc hóa học đối với sự phát triển đường kính (cm) của khu n ty nấm Bipolaris p. t ng điều kiện in vitro
Nghiệm thức Thời điểm uan át (giờ sau th nghiệm)
L ại thuốc N ng độ 48h 72h 96h 120h 144h 168h
Tilt super 300EC 46,9 µl/100ml 0,50 a 0,57 ab 0,81 ab 1,20 bcd 1,41 bc 1,60 bc
Tilt super 300EC 93,8 µl/100ml 0,50 a 0,51 a 0,60 a 0,86 ab 1,17 b 1,35 b
Tilt super 300EC 187,6 µl/100ml 0,50 a 0,50 a 0,50 a 0,54 a 0,58 a 0,60 a
Help 400SC 46,9 µl/100ml 0,99 b 1,28 de 1,52 d 1,70 d 1,90 d 2,12 d
Help 400SC 93,8 µl/100ml 0,74 ab 0,96 cd 1,21 bcd 1,50 cd 1,70 cd 1,89 cd
Help 400SC 187,6 µl/100ml 0,74 ab 1,00 cd 1,39 cd 1,66 d 1,85 d 2,05 d
Kasumin 2L 140,5 µl/100ml 1,26 c 1,38 e 1,39 cd 1,71 d 1,99 d 2,16 d
Kasumin 2L 280 µl/100ml 0,84 b 0,90 bcd 1,11 bcd 1,22 bcd 1,42 bc 1,54 bc
Kasumin 2L 560 µl/100ml 0,71 ab 0,86 abc 0,94 abc 1,12 bc 1,26 b 1,44 b
Comcat 150WP 0,016 g/100ml 2,38 e 4,36 g 6,86 f 8,74 f 9,00 e 9,00 e Comcat 150WP 0,032 g/100ml 2,66 f 4,52 g 6,78 f 8,88 f 9,00 e 9,00 e Comcat 150WP 0,062 g/100ml 2,70 f 4,56 g 6,54 f 8,92 f 9,00 e 9,00 e Đối chứng 2,06 d 3,92 f 5,97 e 8,16 e 9,00 e 9,00 e Mức ý ngh a * * * * * * CV (%) 15,94 14,22 13,01 10,36 6,06 6,73
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % ns: khác biệt không ý nghĩa thống kê Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%
19
Hiệu uả ức chế (%) sự phát triển khuẩn ty của nấm Bipolaris sp. được trình bày ở Bảng 3.2. Ở thời điểm 24 GSTN, hiệu uả ức chế của các nghiệm thức xử lý Tilt super 300EC, Help 400SC và Kasumin 2L đều khá cao, khoảng 60-70%, nhưng khác biệt không ý ngh a so với nghiệm thức đối chứng. Tại thời điểm này, các nghiệm thức xử lý bằng Comcat 150WP đều cho hiệu uả thấp hơn có ý ngh a so với nghiệm thức đối chứng. Ở các thời điểm uan sát tiếp theo, các nghiệm thức xử lý Tilt super 300EC, Help 400SC và Kasumin 2L tiếp tục thể hiện hiệu uả cao (trên 70%) và khác biệt có ý ngh a so với nghiệm thức đối chứng. Tại thời điểm khảo sát cuối cùng uan sát (168 GSTN), các nghiệm thức xử lý Tilt super 300EC đều thể hiện hiệu uả trên 80%, cao hơn so với các nghiệm thức khác.
Qua kết uả phân t ch, Comcat 150WP không thể hiện hiệu uả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm Bipolaris sp. trong điều kiện in vitro. Các loại thuốc Tilt super 300EC, Help 400SC và Kasumin 2L đều thể hiện hiệu uả tốt. Trong đó, Tilt super 300EC cho hiệu uả tốt hơn Help 400SC và Kasumin 2L. Kết quả của này tương tự nghiên cứu của Lê Thị Cẩm Tú (2007) cho biết 3 loại thuốc Tilt super 300EC, Dithane-M45 80WP và Folicur 250WP có hiệu quả cao lên sự phát triển khuẩn ty nấm Bipolaris sp.
20
Bảng .2. Hiệu uả ức chế ( ) ự phát t iển khu n ty nấm Bipolaris sp. của ốn l ại thuốc h a học t ng điều kiện in vitro
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % ns: khác biệt không ý nghĩa thống kê
Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5 %
Nghiệm thức Thời điểm uan át (giờ sau th nghiệm)
Loại thuốc N ng độ 48h 72h 96h 120h 144h 168h
Tilt super 300EC 46,9 µl/100ml 75,59 a 85,62 a 86,17 a 85,06 a 84,33 d 82,22 e
Tilt super 300EC 93,8 µl/100ml 75,59 a 87,00 a 89,98 a 89,26 a 87,00 b 85,00 b
Tilt super 300EC 187,6 µl/100ml 75,99 a 87,16 a 91,55 a 93,33 a 93,56 a 93,33 a
Help 400SC 46,9 µl/100ml 52,02 a 67,46 a 73,79 a 79,29 a 78,98 g 76,44 h Help 400SC 93,8 µl/100ml 63,81 a 75,37 a 79,51 a 81,37 a 81,11 e 79,00 f Help 400SC 187,6 µl/100ml 63,76 a 74,22 a 76,94 a 79,33 a 79,44 f 77,22 g Kasumin 2L 140,5 µl/100ml 38,18 a 64,39 a 76,58 a 78,67 a 77,89 h 76,00 i Kasumin 2L 280 µl/100ml 59,18 a 76,92 a 81,19 a 84,95 a 84,22 d 82,89 d Kasumin 2L 560 µl/100ml 65,17 a 77,88 a 84,09 a 86,15 a 86,00 c 84,00 c Comcat 150WP 0,016 g/100ml 0,00 b 0,00 b 0,00 b 0,00 b 0,00 i 0,00 j Comcat 150WP 0,032 g/100ml 0,00 b 0,00 b 0,00 b 0,00 b 0,00 i 0,00 j Comcat 150WP 0,062 g/100ml 0,00 b 0,00 b 0,00 b 0,00 b 0,00 i 0,00 j Đối chứng 0,00 b 0,00 b 0,00 b 0,00 b 0,00 i 0,00 j Mức ý ngh a * * * * * * CV (%) 13,42 7,72 10,11 14,73 0,58 0,65
21
3.1.2 Hiệu quả đối kháng của 4 loại thuốc lên sự phát triển của nấm Pithomyces
sp. gây bệnh lem lép hạt t ên lúa t ng điều kiện in vitro
Đường kính tản nấm Pithomyces sp. ở các nghiệm thức xử lý Tilt super 300EC, Help 400SC, Kasumin 2L và Comcat 150WP vào các thời 48, 72, 96, 120, 144 và 168 GSTN được ghi nhận ở Bảng 3.3. Kết uả cho thấy ngoại trừ các nghiệm thức xử lý Comcat 150WP thì các nghiệm thức còn lại (ở cả ba nồng độ khảo sát) đều cho hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty của nấm Pithomyces sp. và khác biệt có ý ngh a so với đối chứng ở tất cả các thời điểm uan sát. Các nghiệm thức xử lý Tilt super 300EC, Help 400SC và Kasumin 2L đều cho khả năng ức chế
nấm Pithomyces sp. và khác biệt có ý ngh a so với đối chứng. Ở thời điểm 48
GSTN, trung bình ĐKKT của các nghiệm thức xử lý thuốc (trừ Comcat 150WP) thấp hơn có ý ngh a so với trung bình ĐKKT của đối chứng (0,92 cm) và dao động trong khoảng 0,5-0,8 cm và thấp hơn trung bình ĐKKT của nghiệm thức Comcat 150 WP (dao động từ 1,43-1,71 cm). Ở các thời đểm 72, 96, 120, 144, 196 GSTN, các nghiệm thức đều có khả năng ức chế sự phát triển ĐKKT như ở thời điểm 48h. Trong đó, Tilt super 300EC có khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm cao nhất (các nghiệm thức ở cả 3 nồng độ đều có ĐKKT 0,5 cm), kế đến là Help 400SC dao động 0,58-0,83 cm và Kasumin 2L trong khoảng 0,62- 2,51 cm.
22
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của bốn thuốc hóa học đối với sự phát triển đường kính khu n ty nấm Pithomyces p. t ng điều kiện in vitro
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % ns: khác biệt không ý nghĩa thống kê
Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5 %
Nghiệm thức Thời điểm uan át (giờ sau th nghiệm)
Loại thuốc N ng độ 48h 72h 96h 120h 144h 168h
Tilt super 300EC 46,9 µl/100ml 0,5 g 0,5 e 0,5 f 0,5 g 0,5 g 0,5 g Tilt super 300EC 93,8 µl/100ml 0,5 g 0,5 e 0,5 f 0,5 g 0,5 g 0,5 g Tilt super 300EC 187,6 µl/100ml 0,5 g 0,5 e 0,5 f 0,5 g 0,5 g 0,5 g Help 400SC 46,9 µl/100ml 0,58 fg 0,91 c 0,76 e 0,76 f 0,81 f 0,81 f Help 400SC 93,8 µl/100ml 0,61 f 0,70 d 0,72 e 0,74 f 0,82 f 0,82 f Help 400SC 187,6 µl/100ml 0,64 ef 0,69 d 0,72 e 0,74 f 0,83 f 0,83 f Kasumin 2L 140,5 µl/100ml 0,72 de 1,08 c 1,34 c 1,75 c 2,19 c 2,51 c Kasumin 2L 280 µl/100ml 0,78 cd 1,00 c 1,25 c 1,60 d 1,90 d 2,21 d Kasumin 2L 560 µl/100ml 0,62 f 0,98 c 1,12 d 1,37 e 1,61 e 1,89 e ComCat 150WP 0,016 g/100ml 1,01 a 1,71 a 2,19 a 2,78 a 3,50 a 4,08 a ComCat 150WP 0,032 g/100ml 0,92 b 1,47 b 1,92 b 2,54 b 3,07 b 3,60 b ComCat 150WP 0,062 g/100ml 0,85 bc 1,43 b 1,94 b 2,52 b 3,14 b 3,64 b Đối chứng 0,92 b 1,47 b 2,00 b 2,60 b 3,20 b 3,69 b Mức ý ngh a * * * * * * CV (%) 9,01 13,76 7,04 6,05 6,74 6,39
23
Hiệu uả ức chế (%) sự phát triển khuẩn ty của nấm Pithomyces sp. trong điều kiện in vitro được ghi nhận trong Bảng 3.4. Ở thời điểm 24 GSTN, ngoại trừ