II.1 VẬT LIỆU
II.1.1 Vi sinh vật
11 chủng thuộc loài Bacillus có trong bộ sưu tập của bộ môn công nghệ sinh học
II.1.2. Vỏ tôm
Vỏ tôm sú có nguồn gốc từ Quảng Ninh ñược ñem rửa loại bẩn, sấy tại 500C và xay nhỏñến kích thước 0,5cm rồi giữ ở tủ lạnh ởñiều kiện 40C.
II.1.3 Các loại thiết bị sử dụng
a, Các thiết bị dùng trong nuôi cấy và giữ giống
• Thiết bị thanh trùng
• Tủ cấy
• Tủấm
• Tủ lắc
• Tủ lạnh(giữ giống)
b, Các thiết bị dùng trong phương pháp hoá sinh
• Máy ño quang OD c, Các thiết bị khác • Máy ño pH • Máy khuấy từ • Lò vi sóng • Cân ñiện tử • Máy ly tâm • Tủ sấy • Máy votex • Bình ổn nhiệt
============================================================== 30
II.1.4 Các môi trường cơ bản sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường giữ giống(1): Cao nấm men 0,5%, Pepton 1%, Glucose 1%
Môi trường xác ñịnh hoạt tính proteaza bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa thạch (2): Pepton 1%, NaCl 0,5%, Sữa gầy1%, Thạch 2%, chỉnh pH=7.
Môi trường nhân giống ñem lên men(3): Glucose 0,5,%, Cao nấm men 0,75%, Dung dịch muối khoáng 5%(trong ñó gồm NaCl 0,5%, KH2PO4 0,5%, MgSO4.7H2O 0,5%, FeSO4.7H2O 0,01 %).
Môi trường xác ñịnh hoạt tính proteaza bằng phương phápkhuyếch tán trên ñĩa thạch (4): Sữa gầy 1%, Thạch 2%, pH=7.
II.1.5 Các hóa chất sử dụng
a, Hoá chất chuẩn bị môi trường nuôi cấy
• Cao nấm men • Pepton • NaCl • Glucoza • KH2PO4 • MgSO4.7H2O • FeSO4.7H2O • Sữa gầy • Thạch agar
b, Hoá chất dùng trong các phương pháp hóa sinh
• Albumin
• Tyrozin
• Casein
• CH3COOH
============================================================== 31 • H3PO4 • NaOH • HCl • CCl3COOH • Na2CO3 • CuSO4 • KNaC4H4O6
• Dung dịch màu folin
II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
II.2.1 Phương pháp vi sinh
II.2.1.1 Phương pháp nuôi cấy lỏng
Lấy 1 vòng que cấy chuyển vào 10 ml môi trường 3 rồi tiến hành nuôi cấy tại nhiệt ñộ, pH và trong khoảng thời gian như chỉ ra trong phần kết quả trên máy lắc ổn nhiệt với tốc ñộ lắc 170 v/p
II.2.1.2 Phương pháp lên men vỏ tôm
Chủng nghiên cứu sau khi nuôi cấy lỏng ñược ñem trộn với vỏ tôm theo tỉ lệ xác ñịnh ñược chỉ rõ trong phần kết quả và ñem nuôi cấy tiếp tại nhiệt ñộ và pH xác ñinh trong khoảng thời gian xác ñịnh trên máy lắc ổn nhiệt với tốc ñộ lắc là 170 v/p
II.2.2 Phương pháp hóa sinh
II.2.2.1 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ proteaza bằng phương pháp
khuyếch tán ñĩa thạch
II.2.2.1.1 Thu dịch proteaza
Sau 24h ta tiến hành thu dịch proteaza, thu canh trường nuôi cấy vào các ống fancol, ñem ly tâm với tốc ñộ là 6000vòng/phút trong vòng 10 phút. Sau khi ly tâm ta loại bỏ sinh khối, thu dịch trong.
============================================================== 32
II.2.2.1.2 Khuếch tán ñĩa thạch
Môi trường (4) sau khi thanh trùng ñược phân phối vào trong hộp petri tương tự như môi trường (2). Ta tiến hành ñục lỗ thạch trong ñiều kiện vô trùng. Sử dụng ñầu côn loại 1ml ta ñục giếng thạch. Nhỏ vào trong giếng thạch vừa ñục 100µm dịch proteaza thu ñược. Sau ñó ñể vào tủ lạnh 1h ñể khuếch tán hết dịch vào trong thạch. Ủ trong tủ ấm 370C quan sát ñường kính vòng thuỷ phân.
II.2.2.2 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ proteaza bằng phương pháp
Anson cải tiến
II.2.2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp
Phương pháp dựa trên cơ sở thuỷ phân protein cazeinat natri bằng chế phẩm enzyme có trong dung dịch nghiên cứu rồi tiếp ñó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng axit tricloaxetic. ðịnh lượng sản phẩm ñược tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào ñồ thị chuẩn của tyrozin ñể tính lượng sản phẩm tương ứug do enzyme xúc tác tạo nên.
II.2.2.2.2 Cách tiến hành
Cho vào 2 ống nghiệm , mỗi ống có 2ml cơ chất, rồi ñặt vào máy ñiều nhiệt ở 300C. Sau 10 phút, cho vào mỗi ống 2ml dung dịch enzim, lắc trộn ñều và ñể cho thuỷ phân ñúng 10 phút ở 300C. ðể ñình chỉ phản ứng enzim bằng cách thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 4ml acixit tricloracetic 0,3M, khi ñó protein dư cũng như sản phẩm thuỷ phân cao phân tử sẽ bị kết tủa. Khuấy trộn nhanh hỗn hợp ñể kết tủa hoàn toàn protein rồi giữ các ống nghiệm ở 300C thêm 20 phút nữa. Sau ñấy lọc hỗn hợp qua giấy lọc khô trên phễu nhỏ vào các ống nghiệm khô khác, dịch lọc phải thật trong. Lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm và thêm vào ñó 5ml dung dịch Na2CO30,5M, khuấy ñều liên tục và thêm 1ml thuốc thử folin phân tích. ðể yên hỗn hợp phản ứng 20 phút. Sau phản ứng dung dịch có màu xanh da trời. ðo cường ñộ màu của dung dịch trên máy so màu quang ñiện ñối ngược với mẫu kiểm chứng.
============================================================== 33
Tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng bằng cách thêm các hoá chất khác theo thứ tự ngược lại : Thêm vào 2ml dung dịch enzim ( có ñộ pha loãng như ở mẫu thí nghiệm ) 4ml axit tricloaxetic 0,3M, giữ hỗn hợp trong máy ñiều nhiệt 10 phút ở 300C, sau ñó mới thêm vào 2ml dung dịch cơ chất và giữ 20 phút ở nhiệt ñộ này. Qua 20 phút, ñem lọc dung dịch. Lấy 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm khô, thêm 5ml Na2CO3 0,5M, khuấy ñều liên tục và cho thêm 1ml thuốc thử folin phân tích.
ðo cường ñộ màu của các dung dịch thí nghiệm bằng máy so màu với các cu-vet có chiều dày lớp hấp thụ ánh sáng là 1cm và ở bước sóng λ =656 – 670nm.
II.2.2.3 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein bằng phương pháp
Biuret
II.2.2.3.1 Chuẩn bị dung dịch màu
Cân 1,5g CuSO4 và 6g KNaC4H4O6 rồi hoà tan trong 500ml dung dịch nước cất và khuấy ñều . Sau ñó thêm 300ml NaOH 10% vào dung dịch vừa pha. ðịnh mức dung dịch ñến vạch ngấn của bình 1000ml bằng nước cất.
II.2.2.3.2 Xây dựng ñường chuẩn
Hoà tan dung dịch phần trăm thể tích Albumin nguyên chất với nước cất sẽ ñược một dung dịch protein cô ñặc có nồng ñộ 10mg/ml. ðường chuẩn sẽ ñược xác ñịnh trong khoảng nồng ñộ từ 0 ñến 0,8 mg/ml ñược pha từ dung dịch mẹ vừa pha. Cho vào mỗi ống nghiệm khoảng 4ml thuốc thử, lắc ñều và ñể phản ứng trong 30 phút. Sau ñó, giá trị màu dung dịch hấp thụ ñược sẽ ñược ño ở bằng máy ño màu ở bước sóng là 570nm.
II.2.2.3.3 Phương pháp tách chiết protein bằng NaOH
Tất cả các thuốc thửñược sử dụng trong phương pháp này là các hoá chất thuộc tính thử.
Cân 1g vỏ tôm cho vào ống fancol thể tích 15ml. Sau ñó thêm vào trong ống nghiệm khoảng 10ml NaOH 3% ngâm qua ñêm ở nhiệt ñộ phòng. Sau ñó ta giữở bình ổn nhiệt ở 900C trong vòng 1h, tiếp tục làm nguội xuống nhiệt ñộ phòng rồi lọc thu dịch trong.
============================================================== 34
Nồng ñộ protein chiết ñược sẽ ở trong phần dịch trong mà chúng ta lọc thu ñược. Dịch lọc mà ta thu ñược ñem ly tâm với tốc ñộ là 6000vòng/phút trong khoảng 20 phút ñể ñảm bảo là ñã loại bỏ hết các phần tử cặn còn lại trong dung dịch chiết. Sau khi ly tâm ta gạn bỏ phần cặn kết tủa chỉ thu dịch trong hoàn toàn. Pha loãng dịch ly tâm ñến nồng ñộ sao cho khi tiến hành phản ứng màu giá trị ño ñược phải nằm trong ñường chuẩn mà chúng ta ñã xây dựng. Sau khi pha loãng ta lấy 1ml dung dịch ñã pha loãng cộng với 4ml dung dịch màu Biuret, ñể phản ứng trong vòng 30phút rồi tiến hành ño giá trị màu bằng máy ño quang ở bước sóng là 570nm.
II.2.3. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm bề mặt ñáp ứng
Sử dụng thiết kế tâm xoay ñối xứng (central composite design CCD) của phương pháp bề mặt ñáp ứng
Giá trị của các biến số thể hiện trong bảng 2
Bảng 2.1. Giá trị mã hóa và thực nghiệm
Giá trị mã hóa Biến số -2 -1 0 +1 +2 CaCl2, A [mg/L] 0 0,5 1 1,5 2 Glucoza, B [mg/L] 0 0,5 1 1,5 2 Thời gian, C [h] 14 16 18 20 22 pH, D 7 8 9 10 11
Phương pháp CCD với 4 yếu tốảnh hưởng với 24 thí nghiệm cộng với 8 ñiểm biên (α=2) và 6 ñiểm tâm (n0=6) tổng cộng là 30 thí nghiệm. Hoạt ñộ proteaza là biến phụ thuộc. Thí nghiệm và kết quả ñược bố trí theo ma trận trình bày ở bảng 1 phụ lục.
============================================================== 35