3.2.1. Vật liệu
Chanh dây chín được thu mua từ các siêu thị Big C, Co.opmart tại Thành Phố Cần Thơ. Chọn trái to bóng, không bị héo, không bị giập.
Dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae của Viện Nghiên Cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học (S. cerevisiae 2.1), Viện Nghiên cứu rượu vang Úc (S. cerevisiae
U) và Trường Đại học UC-Davis Hoa Kỳ (S. cerevisiae M).
Dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae N) có hoạt tính lên men mạnh nhất trong các dòng nấm men được phân lập từ đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men trong quá trình lên men rượu vang nhào”(Lê Thị Diễm Lan, 2013).
Đường cát tinh luyện.
3.2.2. Hóa chất
a) Môi trường nuôi cấy nấm men
- Môi trường YPGA (khoai tây 20%, D-glucose 2%, agar 2%, Yeast extract 1%, (NH4)2SO4 0,2%, nước cất vừa đủ 1000mL).
- Môi trường nuôi sinh khối YEPD (peptone 1%, D-glucose 2%, Yeast extract 2%, nước cất vừa đủ 1000mL).
b) Các hóa chất khác
3.2.3. Dụng cụ - thiết bị
Cân phân tích (Ohaus Corp, ARA520, Mỹ)
Kính hiển vi quang học (Olympus Optical, BH-2, Nhật)
Máy vortex (HEIPOLPH, Đức)
Nồi thanh trùng (Breukelen, Hà Lan)
Tủ ủ (Henrich, Đức)
Water bath & Shaker (GESELLSCHAFT, ĐỨC)
Brix kế
Máy đo pH
Thiết bị chưng cất
Cồn kế
Các dụng cụ thông dụng như: ống nghiệm, pipet, bình tam giác, ống đong, kim cấy….
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Khảo sát khả năng lên men rượu từ dịch chanh dây của các dòng nấm men men
a. Mục đích: Khảo sát cường độ lên men của các dòng nấm men nhẳm chọn ra dòng nấm men có cường độ lên men mạnh cho quá trình lên men rượu vang chanh dây.
b. Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố là các dòng nấm men, bao gồm các dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae của Viện Nghiên cứu rượu vang Úc (S. cerevisiae U), Trường Đại học UC-Davis Hoa Kỳ (S. cerevisiae M), nấm men S. cerevisiae 2.1 của Viện NC&PT CNSH và dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae N) từ Lê Thị Diễm Lan (2013).
c. Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị dung dịch nấm men: tăng sinh khối nấm men đã phân lập trong môi trường YEPD lỏng trong 24 giờ: thêm 10g Peptone, 20g D-glucose và 20g Yeast Extract, nước cất vào đúng 1 lít. Cho 100mL môi trường vào bình tam giác 250mL (mỗi dòng nấm men 1 bình tam giác) đậy bằng giấy bạc, đem khử trùng nhiệt ướt 121°C trong 20 phút, để nguội khoảng 30°C, chủng nấm men vào môi trường nhân giống. Bình môi trường sau khi chủng giống được đậy bằng nút gòn, nắp giấy và đặt trên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ nhiệt độ phòng (khoảng 30-33°C). sau khi nhân giống kiểm tra mật số tế bào nấm men bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
Dùng phương pháp lên men trong chai Durham và phương pháp đo độ rượu sau quá trình lên men.
Chuẩn bị dịch chanh dây được pha loãng theo tỷ lệ 1/1, đo độ Brix dung dịch chanh dây và điều chỉnh ở mức 25°Brix. Sau đó thanh trùng bằng nhiệt trong 3 phút trong Microwave, mỗi lần 1 phút lặp lại 3 lần. (Lí do thanh trùng bằng nhiệt vì khi sử dụng dịch hóa chất NaHSO3 (140g/mL) cho vào dịch chanh dây và cho lên men thì độ rượu sinh ra không cao, thậm chí còn rất thấp. Nguyên nhân có thể do nấm men bị ức chế hay bị tiêu diệt bởi NaHSO3. Vì vậy sử dụng phương pháp thanh trùng bằng nhiệt trong Microwave trong 3 phút là hợp lý với nhiệt độ khoảng 88-91°C trong 15 giây, có khả năng diệt được một số vi sinh vật trong dịch chanh dây).
Bên cạnh tiến thanh trùng 300mL dịch chanh dây bằng NaHSO3 (140g/mL) trong 2 giờ để làm mẫu đối chứng.
Khảo sát trong chai Durham
-Cho 9 mL mỗi dung dịch vào ống nghiệm có chứa chai Durham
-Lấy 1 mL dung dịch mỗi dòng nấm men cho vào ống nghiệm chứa 9mL dịch chanh dây.
-Lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng cho đến khi bọt khí sinh ra chứa đầy chai Durham.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm : 5 x 3=15.
Khảo sát trong bình tam giác
- Cho 100mL dịch chanh dây vào bình tam giác 250mL.
- Chủng 1mL dung dịch mỗi loại nấm men vào 100mL dịch quả trong bình tam giác, đậy kín bằng waterlock và để lên men ở nhiệt độ nhiệt độ phòng trong 7 ngày.
-Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3=15
- Thực hiện mẫu đối chứng với dòng S. cerevisiae 2.1 (nấm men được khảo sát ở nhiều đề tài thí nghiệm trước có hoạt tính lên men mạnh), cho 1mL dịch nấm men vào 100mL dịch chanh dây thanh trùng bằng NaHSO3 (140g/mL). Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đậy kín bằng waterlock và để lên men ở nhiệt độ nhiệt độ phòng trong 7 ngày.
d. Chỉ tiêu theo dõi
+ pH trước và sau lên men.
+ Xác định độ rượu sau lên men: Chưng cất rượu và đo bằng cồn kế. - + Quan sát và đo chiều cao cột khí trong chai Durham
Chọn ra dòng nấm men sinh CO2 làm đầy ống Durham nhanh nhất và cho độ rượu cao sau khi chưng cất.
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng mật số nấm men đến quá trình lên men chanh dây dây
a. Mục đích: Xác định mật số nấm men thích hợp cho quá trình lên men rượu vang chanh dây.
b. Tiến hành thí nghiệm
- Dịch quả: chanh dây ép lấy nước, điều chỉnh nồng độ đường ban đầu (25°Brix) và pH tự nhiên. Sau đó thanh trùng dịch quả bằng nhiệt qua Microwave trong 3 phút (mỗi lần 1 phút, lặp lại 3 lần).
- Chủng 1mL dịch nấm men tìm được ở thí nghiệm 3.3.1 ở mật số 105, 106, 107, 108 và 109 tế bào/mL vào 100mL dịch quả trong bình tam giác và đậy kín bằng waterlock, ủ nhiệt độ nhiệt độ phòng 28-32°C trong 7 ngày. Mật số nấm men trong dịch quả sau khi chủng đạt giá trị lần lượt 103, 104, 105, 106 và 107 tế bào/mL.
Chanh dây chín
Ép lấy nước (xử lý sơ bộ)
Thanh trùng bằng nhiệt trong 3 phút (mỗi lần 1 phút, lặp lại 3 lần) Cho vào bình tam giác 100mL dịch chanh dây
Chủng men (tìm được ở thí nghiệm 3.3.1 mật số 103, 104, 105,106 và 107
tế bào/mL)
Lên men (7 ngày, nhiệt độ nhiệt độ phòng28-32°C)
Chưng cất rượu
Hình 2. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm men đến quá trình lên men rượu vang chanh dây
-Thí nghiệm có 3 mức độ và được lặp lại 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm là 9
d.Chỉ tiêu theo dõi:
+ Độ Brix trước và sau lên men. + pH trước và sau lên men.
+ Xác định độ rượu sau lên men: Chưng cất rượu và đo bằng cồn kế. Chọn ra mật số nấm men phù hợp cho độ rượu cao sau khi lên men.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường và pH đến quá trình lên men rượu vang chanh dây men rượu vang chanh dây
a. Mục đích: Xác định hàm lượng đường và pH dịch chanh dây thích hợp cho quá trình lên men rượu vang chanh dây.
b. Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố:
- Nhân tố A : nồng độ đường (20, 25 và 30°Brix) -Nhân tố B : pH ( 4,0; 5,0 và 6,0)
Tổng số nghiệm thức là 3 x 3 = 9 nghiệm thức, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm là 27.
c.Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị nấm men giống: nấm men được tăng sinh trong môi trường YEPD. Sau 24 giờ tiến hành đếm mật số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu, xác định ở mật số tìm được ở thí nghiệm 3.3.2.
Dịch quả: chanh dây ép lấy nước và pha loãng tỷ lệ 1/1, điều chỉnh nhân tố A độ Brix (bổ sung đường cát tinh luyện). Sau đó điều chỉnh nhân tố B (pH).
Phương pháp điều chỉnh pH: mỗi mức độ Brix được chia ra làm 3 phần để điều chỉnh 3 mức pH khác nhau bằng dung dịch NaHCO3 bão hòa. Sau khi đo pH tự nhiên, dùng pipet 1mL nhỏ từng giọt NaHCO3 vào dich chanh dây cho đến khi đạt mức yêu cầu 4,0; 5,0; 6;0. (Lí do dùng NaHCO3 bão hòa vì để giảm bớt tối thiểu lượng nước cho vào dịch chanh dây, tránh làm tăng thể tích ban đầu của dịch chanh dây).
Thanh trùng dịch quả bằng nhiệt trong 3 phút (mỗi lần 1 phút, lặp lại 3 lần). Sau đó chủng nấm men với mật số thích hợp từ thí nghiệm vào 3.3.2 vào mỗi bình tam giác
chứa 100mL dịch chanh dây, đậy kín bằng waterlock. Lên men khoảng 7 ngày ở nhiệt độ nhiệt độ phòng(28-32°C). Sau đó chưng cất rượu và xác định các thông số độ rượu. Quy trình thực hiện thí nghiệm được tóm tắt trong Hình 3.
Chanh dây chín
Ép lấy dịch, điều chỉnh dịch chanh dây theo các nhân tố: nồng độ đường (20, 25 và 30° Brix) và pH (4,0; 5,0 và 6,0)
Thanh trùng bằng nhiệt trong 3 phút (mỗi lần 1 phút, lặp lại 3 lần)
Cho vào bình tam giác 100mL dịch chanh dây
Chủng men (tìm được ở thí nghiệm 3.3.1 với mật số ở thí nghiệm 3.3.2)
Lên men (7 ngày, nhiệt độ nhiệt độ phòng28-32°C)
Chưng cất rượu
(độ Brix, pH ban đầu thích hợp)
Hình 3. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung và pH ban đầu lên quá trình lên men rượu
d. Các chỉ tiêu theo dõi
+ Độ Brix trước và sau lên men. + pH trước và sau lên men.
+ Xác định độ rượu sau lên men: Chưng cất rượu và đo bằng cồn kế.
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men đến quá trình lên men rượu vang chanh dây lên men rượu vang chanh dây
a. Mục đích: xác định nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên men rượu vang chanh dây.
Thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố:
- Nhân tố A: nhiệt độ lên men (25°C; nhiệt độ nhiệt độ phòngở 28-32°C và 35°C)
- Nhân tố B: thời gian lên men (5; 7; và 9 ngày)
Tổng số nghiệm thức là 3x3=9 nghiệm thức, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm là 27.
c.Tiến hành thí nghiệm
- Thanh trùng dịch quả bằng nhiệt trong 3 phút. Sau đó cho 100mL dịch chanh dây vào bình tam giác 250mL
- Điều chỉnh pH và hàm lượng đường theo kết quả được chọn từ thí nghiệm 3.3.3.
- Chủng 1mL dung dịch nấm men vào dịch chanh theo mật số được chọn từ thí nghiệm 3.3.2 và đậy kín bằng waterlock.
-Ủ các bình tam giác theo các nhiệt độ và thời gian như bố trí thí nghiệm.
d. Chỉ tiêu theo dõi
+ Độ Brix trước và sau lên men. + pH trước và sau lên men.
+ Xác định độ rượu sau lên men: Chưng cất rượu và đo bằng cồn kế.
3.3.5. Thử nghiệm quy trình sản xuất rượu vang chanh dây
a. Mục đích:
Ở các thí nghiệm trên đã tìm được các thông số về: dòng nấm men, mật số nấm men, độ Brix, pH, thời gian, nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men rượu vang chanh dây.
Thí nghiệm này được thực hiện với các thông số trên nhằm đánh giá sản phẩm rượu vang chanh dây, từ đó đề xuất quy trình sản xuất rượu vang chanh dây.
b. Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm này tiến hành với các chỉ tiêu: dòng nấm men S. cerevisiae 2.1 có mật số 107 tế bào/mL, 25°Brix, pH 4,0; nhiệt độ phòng (28-32°C), thời gian 9 ngày. Thí nghiệm thực hiện với thể tích 1,5l.
Chanh dây chín
Ép lấy dịch, xử lý sơ bộ
Thanh trùng bằng nhiệt trong 3 phút (mỗi lần 1 phút, lặp lại 3 lần)
Cho vào bình tam giác 100mL dịch chanh dây Chủng nấm men Lên men
Rượu vang chanh dây
Hình 4. Quy trình sản xuất rượu vang chanh dây
c. Chỉ tiêu theo dõi : Độ Brix, pH, độ rượu sau lên men
d. Chỉ tiêu cảm quan được phân tích
-Màu sắc -Mùi -Vị
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khả năng lên men rượu từ dịch chanh dây của các dòng nấm men 4.1.1. Khả năng lên men trong chai Durham 4.1.1. Khả năng lên men trong chai Durham
Khả năng lên men của các chủng nấm men được đánh giá sơ bộ dựa trên khả năng tạo bọt khí trong chai Durham. Nấm men được chủng 1mL vào ống nghiệm có chai Durham chứa 9 mL dịch chanh dây. Sau đó chiều cao cột khí được đo trong 40 giờ đầu lên men. Kết quả khảo sát khả năng lên men dịch chanh dây với 4 chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae U, S. cerevisiae N, S. cerevisiae M, S. cerevisiae 2.1) được trình bày trong Bảng 3.
Bảng 3. Chiều cao trung bình cột khí CO2 (cm) trong chai Durham
Chủng nấm men Thời điểm lên men (giờ)
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
S. cerevisiae 2.1 0,61 1,21 2,55 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00
S. cerevisiae N 0,52 1,15 2,48 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00
S. cerevisiae U 0,00 0,20 0,48 0,82 1,35 1,97 2,46 2,85 3,00 3,00
S. cerevisiae M 0,00 0,00 0,20 0,52 0,98 1,48 1,79 2,21 2,75 3,00
Ghi chú: Chiều cao tối đa chuông Durham là 3cm.
Kết quả ở Bảng 3 cho thấy có sự khác biệt về khả năng lên men giữa 4 chủng nấm men. Sau 4 giờ, chủng nấm men S. cerevisiae 2.1 và S. cerevisiae N bắt đầu lên men, sinh bọt khí và chiều cao cột khí tăng lên liên tục, đến 16 giờ cột khí chiếm đầy ống (3,00cm). Dòng S. cerevisiae U bắt đầu sinh bọt khí sau 8 giờ và cột khí tăng liên tục đến 36 giờ thì đạt 3,00cm. Cường độ lên men của dòng S. cerevisiae M yếu hơn 3 dòng còn lại, bắt đầu sinh bọt khí sau 12 giờ và đến 40 giờ cột khí mới đạt 3,00cm.
Như vậy, dựa vào thời gian lượng CO2 chiếm đầy ống Durham sớm nhất, dòng nấm men S. cerevisiae 2.1 và S. cerevisiae N được xác định có hoạt lực lên men mạnh nhất so với 3 dòng còn lại. Tuy nhiên, thời gian lên men trong chai Durham khá ngắn so với quá trình lên men rượu nên phương pháp đo chiều cao cột khí chỉ là cơ sở ban đầu để khảo sát hoạt tính của các dòng nấm men.
4.1.2. Khả năng lên men trong bình tam giác
Khả năng lên men của các dòng nấm men được khảo sát trong bình tam giác với mật số nấm men là 107 tế bào/ mL trong dịch chanh dây, thời gian lên men 7 ngày ở nhiệt độ phòng; pH được điều chỉnh 4,0 (pH tự nhiên 2,7) và nồng độ đường của dịch chanh dây là 9°Brix được điều chỉnh về 25°Brix bằng đường saccharose.
U N M 2.1 14 12 10 8 6 4 2 0 Dòng nấm men Đ ộ rư ợ u ( % v /v ở 2 0 °C ) 8,45b 13,34a 8,76b 13,94a
Hình 5. Khả năng lên men rượu trong dịch quả chanh dây của các dòng nấm men
*Ghi chú: Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại; các giá trị có cùng ký tự khác biệt không có ý nghĩa
thống kê ở mức độ ý nghĩa 5%.
Hình 5. cho thấy dòng nấm men S. cerevisiae 2.1 và S. cerevisiae N khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê nhưng lại có sự khác biệt ý nghĩa với 3 dòng nấm men dòng S. cerevisiae U và S. cerevisiae M ở mức 5%. Tuy nhiên, qua kết quả thống kê, mặc dù dòng S. cerevisiae 2.1 và dòng S. cerevisiae N khác biệt không có ý nghĩa nhưng về độ cồn thì dòng S. cerevisiae 2.1 (13,94% v/v ở 20°C) cao nhất, cao hơn so với S. cerevisiae N (13,34% v/v ở 20°C) và cao hơn nhiều đối với 2 dòng S. cerevisiae
U (8,45% v/v ở 20°C) và S. cerevisiae M (8,76% v/v ở 20°C). Qua đó chứng minh dòng S. cerevisiae U và S. cerevisiae M lên men yếu hơn S. cerevisiae 2.1 và S. cerevisiae N, cho sản phẩm có độ rượu thấp. Độ rượu là chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá khả năng lên men rượu của nấm men và chất lượng rượu. Độ rượu cao cũng
S. cerevisiae M
là điều kiện tốt để bảo quản vì ở độ rượu cao vi khuẩn bị ức chế sự phát triển (Lương Đức Phẩm, 1998). Vì vậy, dòng S. cerevisiae 2.1 được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2. Ảnh hưởng của mật số nấm men đến quá trình lên men
Số lượng tế bào nấm men chủng vào dịch nấm men có ảnh hưởng đến quá trình lên men. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men diễn ra tốt, hiệu suất thu hồi cao và chất lượng sản phẩm tốt. Ngược lại lượng nấm men cho vào ít thì tốc độ lên men chậm, sinh khối tế bào nấm men thấp tạo điều kiện cho nấm men phát triển, hạn chế quá trình lên men yếm khí. Nếu số lượng nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ cho nấm men phát triển, sản phẩm sinh ra mùi lạ, đồng thời làm lãng phí nấm men một cách vô nghĩa.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm men dòng S. cerevisiae 2.1 đến quá trình lên men rượu vang chanh dây được khảo sát với thời gian lên men 7 ngày ở