Một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men là nhiệt độ. Bảng 9 cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng ethanol sinh ra là có ý nghĩa (ở mức độ tin cậy 95%) (Phụ lục 4). Cụ thể, khả năng lên men ethanol đạt cao nhất ở 30-32oC (khoảng 4,41% v/v, cao hơn 0,78% v/v so với ethanol ở 25oC); ở 37oC, khả năng lên men ethanol đạt kém nhất, thấp hơn 1,6 lần so với mức tối đa đã nêu. Điều này được giải thích là do nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của các loại enzyme xúc tác quá trình chuyển hóa và trao đổi chất trong tế bào nấm men. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm menlà 28-32oC (Lương Đức Phẩm, 2009). Ở nhiệt độ 37oC, quá trình trao đổi chất bị đình trệ do sự bất hoạt hoặc thậm chí biến tính của ít nhất một enzyme chủ chốt. Bên cạnh đó, quá trình lên men ở nhiệt độ cao tạo ra nhiều sản phẩm phụ làm tổn thất lượng ethanol sinh ra (Ngô Thị Phương Dung et al., 2011).
Bảng 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ethanol
STT Nhiệt độ (oC) Ethanol sinh ra (% v/v)
Hiệu suất tiêu thụ glucose (%)
1 25 3,57b 93,75b
2 30-32 4,23a 95,15a
3 37 2,97c 90,47c
Ghi chú: Các giá trị là trung bình của 12 lần lặp lại; trong cùng một cột, các giá trị có cùng chữ thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
Xét về nhân tố thời gian, nhìn chung tất cả các nghiệm thức đều cho kết quả nồng độ ethanol sinh ra tăng lên sau 7 ngày lên men và giảm nhẹ trong 2 ngày sau đó (Bảng 10) và kết quả thống kê theo nhân tố này cũng thể hiện điều tương tự (Phụ lục 4).
Bảng 10. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men ethanol
STT Thời gian (ngày)
Ethanol sinh ra (% v/v)
Hiệu suất tiêu thụ glucose (%)
1 3 1,85d 85,68d
2 5 3,75c 93,76c
3 7 4,42a 95,63b
4 9 4,32b 97,43a
Ghi chú: Các giá trị là trung bình của 12 lần lặp lại; trong cùng một cột, các giá trị có cùng chữ thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
Để có thể thấy được mức độ ảnh hưởng của thời gian đến lượng ethanol sinh ra một cách cụ thể, cần lưu ý rằng hệ lên men trong thí nghiệm này là hệ kín và môi trường lên men ở dạng lỏng; điều đó có nghĩa là có sự tồn tại của pha sinh trưởng và pha sản xuất theo thứ tự trước-sau tương ứng. Theo Lương Đức Phẩm (2009), trong pha sinh trưởng, lượng dinh dưỡng bị tiêu hao nhằm phục vụ cho sinh sản và phát triển tăng sinh khối; lúc này, ethanol sinh ra chưa nhiều. Trong pha sản xuất diễn ra sau đó, nguồn carbon được chuyển hướng sang phục vụ quá trình sản sinh ethanol. Vậy, dựa vào biểu đồ trên và kết quả thống kê có thể thấy sau 5 ngày, nấm men vẫn đang ở giai đoạn sinh trưởng (ethanol đạt chỉ 3,75% v/v). Sau 7 ngày chúng đã bước sang pha sản suất và lượng ethanol được ghi nhận đạt trung bình 4,42% v/v. Tuy nhiên sau 9 ngày, quá trình lên men bước vào giai đoạn kết thúc, lượng ethanol thu được có chiều hướng giảm mặc dù glucose vẫn tiếp tục được tiêu thụ. Điều này được giải thích là do sự phát triển của một số vi khuẩn acid lactic sử dụng phần đường còn sót lại để tạo thành acid lactic, ức chế sự phát triển của nấm men, đồng thời một số vi khuẩn cũng có khả năng phân giải ethanol trong quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng (Lockington et al., 1985).
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ (25-37oC) đến khả năng sản sinh ethanol sau 3-9 ngày được trình bày trong Bảng 10. Đáng lưu ý, lượng ethanol sinh ra khi lên men ở 30oC trong 7 ngày đạt 5,14%, cao nhất trong tất cả các nghiệm thức và lượng glucose được tiêu thụ tương ứng đạt 97,71% (Bảng 11).
Bảng 11. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình lên men ethanol
STT
Nhân tố Chỉ tiêu theo dõi Nhiệt độ (oC) Thời gian (ngày) Nồng độ ethanol sinh ra (% v/v) ở 20oC Hiệu suất tiêu thụ glucose (%) 1 25 3 1,77 h 87,36 j 2 25 5 3,78 d 94,11 f 3 25 7 4,40 c 96,42 e 4 25 9 4,31 c 97,13 c 5 30 3 2,05 g 87,69 i
8 30 9 5,04 a 98,36 a
9 37 3 1,72 h 82,01 k
10 37 5 2,81 f 90,27 h
11 37 7 3,71 de 92,80 g
12 37 9 3,63 c 96,79 d
Ghi chú: Trong cùng một cột, những chữ cái giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (ở mức độ tin cậy 95%).
Như vậy, nhiệt độ 30oC và thời gian 7 ngày được chọn làm 2 trong các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân vỏ trái ca cao.
4.4. Thử nghiệm sản xuất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi có được các giá trị thích hợp cho quá trình lên men ethanol từ vỏ trái ca cao, tiến hành đánh giá khả năng lên men trên quy mô 200-1000 mL. Kết quả lượng ethanol sinh ra và hiệu suất tiêu thụ glucose được thể hiện tương ứng trong Bảng 12.
Bảng 12. Lượng ethanol sinh ra và hiệu suất tiêu thụ glucose khi lên men với thể tích 200, 500 và 1000 mL
STT
Nhân tố Chỉ tiêu theo dõi
Thể tích lên men (mL) Thời gian (ngày) Ethanol sinh ra (% v/v) ở 20oC
Hiệu suất tiêu thụ glucose (%) 1 200 7 5,11 b 97,47 d 2 200 9 5,03 b 97,69 bc 3 200 11 5,05 b 97,70 bc 4 500 7 4,45 c 96,84 e 5 500 9 5,25 a 97,56 cd 6 500 11 5,24 a 97,96 a 7 1000 7 4,06 d 95,97 f 8 1000 9 5,31 a 97,54 cd 9 1000 11 5,25 a 97,85 ab
Ghi chú: Xét theo từng chỉ tiêu: các giá trị có cùng chữ thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%
Biểu đồ cho thấy sự tương quan giữa thời gian và thể tích cơ chất lên men. Một điều cần lưu ý là tất cả các nghiệm thức đều là lên men ủ lắc có bổ sung giá thể, lúc này quá trình lên men là động và cơ hội cho tất cả tế bào nấm men tiếp xúc với cơ chất là như nhau. Khi thể tích cơ chất là 200 mL, độ cồn sinh ra mặc dù có khác biệt nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (chênh lệch không quá lớn giữa 7 ngày và 9 ngày). Khi thể tích cơ chất là 500 và 1000 mL thì độ cồn khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 7 ngày và 9 ngày. Trong đó, ở thời gian 7 ngày, thể tích càng cao cho độ cồn càng thấp do thể tích ít thì nấm men lên men nhanh hơn do cơ chất ít, còn thể tích cao, nấm
men phải cần thời gian thích nghi và tăng sinh nhiều hơn (pha log kéo dài hơn so với thể tích cơ chất ít). Điều đó dẫn tới thời gian tiến hành lên men chậm hơn so với nấm men có trong thể tích cơ chất ít làm cho độ cồn thấp hơn so với thể tích ít do lên men chưa triệt để. Vì vậy khi thời gian tăng lên 9 ngày thì độ cồn của nghiệm thức có thể tích càng cao thì cho độ cồn càng cao do thời gian kéo dài làm cho nấm men lên men triệt để cơ chất hơn.
Đối với nghiệm thức 9 ngày lên men, thể tích 500 và 1000 mL cho kết quả độ cồn khác biệt nhưng không có ý nghĩa thống kê. Kết quả cho thấy, dù nồng độ cơ chất cao, nhưng nấm men chỉ thực hiện lên men phân giải cơ chất với một thể tích nhất định rồi ngừng lên men, do trong giai đoạn này nấm men suy yếu và chết dần làm quá trình lên men ngừng lại. Khi thời gian lên men tăng lên 11 ngày, nhận thấy lượng ethanol không tăng nữa chứng tỏ quá trình lên men đã chấm dứt sau 9 ngày. Vậy, thể tích lên men có thể được gia tăng mà vẫn giữ lượng ethanol tạo thành ở mức 5,0-5,3% (v/v), nhờ đó quá trình lên men thể tích lớn mang tính khả thi cao.
Tóm lại, quá trình sản xuất ethanol từ vỏ trái ca cao trải qua hai giai đoạn chính bao gồm thủy phân và lên men ethanol. Quá trình thủy phân đã được đề cập trong đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường (mã số TSV2013-24); trong đó, theo tính toán sơ bộ thì từ 1 kg vỏ ca cao tươi sau khi được sấy khô và trải qua 8 giờ thủy phân thu được 1,7 L dịch thủy phân có nồng độ glucose là 7,22% (w/v). Tiếp theo đó, quá trình lên men diễn ra trong 7 ngày và nồng độ ethanol sinh ra đạt 5,14% (v/v). Như vậy, từ 1 kg vỏ ca cao tươi thu được khoảng 1,7 L ethanol 5,14%. Kết quả này chỉ ra tiềm năng cho việc sản xuất ethanol sinh học từ một nguồn phế phẩm nông nghiệp là vỏ trái ca cao.
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Điều kiện thích hợp cho quá trình lên men ethanol: sử dụng chủng nấm men
Saccharomyce cerevisiae (VVĐ3) để lên men với mật số giống chủng là 106 tế bào/mL, nhiệt độ lên men 30-32oC, glucose ban đầu đạt 7% (w/v), pH ban đầu 5,5 trong 7 ngày. Nồng độ ethanol tạo thành đạt 5,14 % (v/v).
5.2. Đề nghị
Tiến hành thử nghiệm sản xuất trên quy mô lớn để đánh giá tốt hơn hiệu quả kinh tế và môi trường của toàn quá trình từ thủy phân tới lên men.
Nghiên cứu biện pháp giải quyết các độc tố và các chất ức chế nấm men trong dịch thủy phân vỏ trái ca cao trước khi tiến hành lên men.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc. 2004. Công nghệ sản xuất rượu bia và nước giải khát, trường Đại học Cần Thơ, trang 56-122.
Lương Đức Phẩm. 2009. Nấm men công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, trang 122-331.
Ngô Thị Phương Dung, Lý Huỳnh Liên Hương và Huỳnh Xuân Phong. 2011. Phân lập, tuyển chọn nấm men và xác định điều kiện ảnh hưởng quy trình lên men rượu vang dưa hấu. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 18b: 137-145.
Nguyễn Thị Thanh Hồng. 2013. Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên lên men rượu vang chôm chôm java. Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ.
Trần Diệu Lý. 2008. Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ. Trường Đại học Bách khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, trang 5-25.
Trần Thị Diệu. 2013. Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên lên men rượu vang mận An Phước. Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ.
Tiếng Anh
Akpan, UG, Kovo, AS, Abdullahi, M, and Ijah, JJ. 2005. The production of ethanol from maize cobs and groundnut shells. AU JT, 9(2), 106-110.
Akpan and Kovo. 2009. Ethanol production from corn and bean pod. Department of Biotechnology, Cambridge University, United Kingdom, 20-35.
Andreesen, J. R., Schaupp, A., Neurauter, C., Brown, A., and Ljungdahl, L. G. 1973. Fermentation of glucose, fructose, and xylose by Clostridium thermoaceticum.
J Bacteriol, 114(2), 743-751.
Alvira, P, Tomás-Pejó, E, Ballesteros, M, and Negro, MJ. 2010. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology, 101(13), 4851-4861. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Optimization of dilute acid pretreatment using response surface methodology for bioethanol production from cellulosic biomass of rice polish. Pakistan Journal of Botany, 44(1), 169-176.
Ausubel Ed.. 1994. Current Protocols in Molecular Biology. Applied Microbiology and Biotechnology, 30(6), 300-421.
Bateman, J. V. and Fresnille, O. 1967. Digestibility of Theobroma cacao pods when fed to cattle. J. agric. Science. 68, 23-25.
Bennett, C. 1971. Spectrophotometric acid dichromate method for the determination of ethyl alcohol. The American journal of medical technology, 37(6), 217.
Cara, C., Ruiz, E., Oliva, J. M., Saez, F., and Castro, E. 2008. Conversion of olive tree biomass into fermentable sugars by dilute acid pretreatment and enzymatic saccharification. Bioresour Technol, 99(6), 1869-1876. doi: 10.1016/j.biortech.2007.03.037.
Casey, G. P., Magnus, C. A., and Ingledew, W. M. 1984. High-gravity brewing: effects of nutrition on yeast composition, fermentative ability, and alcohol production. Applied and Environmental Microbiology, 48(3), 639-646.
Charnomordic, B., David, R., Dochain, D., Hilgert, N., Mouret, J.-R., Sablayrolles, J.- M., and Wouwer, A. V. 2010. Two modelling approaches of winemaking: first principle and metabolic engineering. Mathematical and Computer Modelling of Dynamical Systems, 16(6), 535-553.
Classen, P.A.M. 1999. Utilization of the biomass for the supply of energy carries.
Appl. Microbiol.Biotechnol, 741-755.
Foston, Marcus, and Ragauskas, Art J. 2010. Changes in lignocellulosic supramolecular and ultrastructure during dilute acid pretreatment of Populus
and switchgrass. Biomass and Bioenergy, 34(12), 1885-1895.
Galazzo, J. L., and Bailey, J. E. 1990. Fermentation pathway kinetics and metabolic flux control in suspended and immobilized Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, 12(3), 162-172.
Hoseinpour, H., Karimi, K., Zilouei, H., and Taherzadeh, M. J. 2010. Simultaneous pretreatment of lignocellulose and hydrolysis of starch in mixtures to sugars. BioResources. J Bacteriol, 2457-2469.
Kamarudin, M. H., Nadir, N., Mel, M., and Karim. 2011. Comparison of sago and sweet sorghum for ethanol production using Saccharomyces cerevisiae.
Microbiol.Biotechnol, 200-210.
Kulkarni, M. K., Kininge, P. T., Ghasghase, N. V., Mathapati, P. R., and Joshi, S. S. 1998. Effect of additives on alcohol production and kinetic studies of S. cerevisiae for sugar cane wine production. Biotechnol Bioengineering, 121-132. Leenakul, W, and Tippayawong, N. 2010. Dilute acid pretreatment of bamboo for fermentable sugar production. Journal of Sustainable Energy and Environment,
1, 117-120.
Lockington, R. A., Scaly-Lewis, H. M., Scazzocchio, C., and Davies, R. W. 1985. Cloning and characterization of the ethanol utilization regulon in Aspergillus nidulans. Gene, 33(2), 137-149.
Lorch, H. J., Benckieser, G., and Ottow, J. C. G. 1995. Basic methods for counting microorganisms in soil and water. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, 146-161.
Maurice, M. L. 2011. Factors Effecting Ethanol Fermentation Via Simultaneous Saccharification and Fermentation. Doctoral dissertation, Worcester Polytechnic Institute, 1-42.
Mosier, N., Wyman, C., Dale, B., Elander, R., Lee, Y. Y., Holtzapple, M., and Ladisch, M. 2005. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresour Technol, 96(6), 673-686.
Owusu-Domfeh, K. 1972. The future of cocoa and its by-products in the feeding of livestock. Ghana Journal of Agricultural Science, 5, 57-64.
Oyenuga, V. A. 1959. Nigerian’s feedingstuffs. Ibadan: Ibadan University. Press, Nigeria.
Pampulha, M. E., and Loureiro-Dias, M. C. 1989. Combined effect of acetic acid, pH and ethanol on intracellular pH of fermenting yeast. Applied Microbiology and Biotechnology, 31(5-6), 547-550.
Pingali, Sai Venkatesh, Urban, Volker S, Heller, William T, McGaughey, Joseph, O’Neill, Hugh, Foston, Marcus, . . . Evans, Barbara R. 2010. Breakdown of cell
Rocha, M. V., Rodrigues, T. H., de Macedo, G. R., and Goncalves, L. R. 2009. Enzymatic hydrolysis and fermentation of pretreated cashew apple bagasse with alkali and diluted sulfuric Acid for bioethanol production. Appl Biochem Biotechnol, 155(1-3), 407-417. doi: 10.1007/s12010-008-8432-8.
Saha, B. C., Iten, L. B., Cotta, M. A., and Wu, Y. V. 2005. Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification, and fermentation of rice hulls to ethanol. Biotechnol Prog, 21(3), 816-822. doi: 10.1021/bp049564n.
Samah, O. A., Sias, S., Hua, Y. G., and Hussin, N. N. 2011. Production of Ethanol from Cocoa Pod Hydrolysate. ITB Journal of Science, 43 (2), 87-94.
Taherzadeh, M. J., and Karimi, K. 2008. Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review. Int J Mol Sci, 9(9), 1621- 1651. doi: 10.3390/ijms9091621.
Tasun, K., Chose, P., and Ghen, K. (1970). Sugar determination of DNS method. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Biotechnology and Bioengineering, 12, 921.
Trumbly, R. J. 1992. Glucose repression in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Molecular microbiology, 6(1), 15-21.
Tu, Y.-j. 2010. A Study on the Structure of Bagasse with Dilute Acid Pretreatment for Producing Bioethanol. J Bacteriol, 520-278.
Turk, J. 2007. The effect of fermentation temperature on the growth kinetics of wine yeast species. Turk J Agric For, 31, 349-354.
Verduyn, C., Postma, E., Scheffers, W. A., and Van Dijken, J. P. 1992. Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: A continuous‐culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation. Yeast, 8(7), 501-517.
Trang web http://kefir.wikidot.com(ngày 12/07/2013). http://indexmundi.com/commodities/glossary/forastero-cocoa-bean(ngày 15/09/2013). Trang web http://kefir.wikidot.com(ngày 12/07/2013). http://www.indexmundi.com/commodities/glossary/forastero-cocoa-bean (Ngày 08/08/2013).
PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các hình ảnh thí nghiệm
Kính hiển vi quang học Cân phân tích Bình hút ẩm
Máy ủ lắc gia nhiệt Máy ly tâm Máy đo quang phổ
Đường chuẩn glucose từ 0,005 đến 0,055 (% w/v)