Nội dung nghiên cứu - nghiên cứu điều kiện lên men- 123docz.net

3.3.1. Ảnh hưởng của loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol

Mục đích: Xác định chủng nấm men thích hợp và mật số giống chủng ban đầu ứng với từng chủng để đạt hiệu quả lên men cao nhất.

Tiến hành:

- Thí nghiệm 2 nhân tố (loại nấm men và mật số vi sinh vật ban đầu) với 3 lần lặp lại:

+ Nhân tố loại nấm men gồm 4 mức độ tương ứng với 4 chủng nấm men: YB3K, VVĐ3, BKĐ4 và 2.1.

+ Nhân tố mật số giống chủng có 4 mức độ: 102, 104, 106, 107 tế bào/mL.

Tổng số nghiệm thức: 4x4=16 nghiệm thức. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 16 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 48 đơn vị thí nghiệm.

- Nuôi cấy nấm men lên men ethanol trong môi trường nuôi sinh khối đến khi mật số tế bào nấm men đạt yêu cầu như trên.

- Cho 100 mL dung dịch thuỷ phân vỏ ca cao vào bình tam giác 250 mL, khử trùng bằng NaHSO3 (0,140 g/L) trong 30 phút.

- Chủng 1 mL dung dịch nấm men hoặc vi khuẩn đã nuôi cấy vào các bình tam giác.

- Ủ trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock) ở nhiệt độ phòng.

- Sau 5 ngày ủ, tiến hành định lượng ethanol, quy về nồng độ ethanol ở 20ºC. Các yếu tố được giữ cố định: nhiệt độ môi trường (30-32oC); pH ban đầu 5,5; nồng độ glucose ban đầu là 6% (w/v) nhằm tiết kiệm chi phí thủy phân trong quá trình tiến hành thí nghiệm.

Chỉ tiêu theo dõi: khả năng lên men tạo ethanol ở các mật số giống chủng khác nhau; lượng đường khử được tiêu thụ và hiệu suất phân giải glucose tương ứng.

Kết quả: Xác định được chủng nấm men và mật số ban đầu thích hợp cho quá trình lên men ethanol. Kết quả phân tích phương sai và LSD của tất cả số liệu được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion phiên bản XV.

3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu và pH ban đầu đến quá trình lên men ethanol

Mục đích: Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu trong dịch lên men và pH ban đầu đến quá trình lên men ethanol.

Tiến hành:

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại: nồng độ glucose ban đầu có 4 mức độ: 4, 5, 6 và 7% (w/v) và pH ban đầu có 4 mức độ

(4,5; 5; 5,5 và 6). Tổng số nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 16 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 48.

- Tiến hành: cho vào bình tam giác 100 mL dịch vỏ ca cao được thủy phân với nồng độ glucose và pH ban đầu như trên. Nồng độ glucose được điều chỉnh bằng cách pha loãng dung dịch thuỷ phân bằng nước cất vô trùng và pH được điều chỉnh bằng acid citric 10%. Thanh trùng bằng NaHSO3 với nồng độ 140 mg/L trong 30 phút. Chủng giống nấm men với mật số đã khảo sát. Đậy kín bình bằng waterlock và tiến hành lên men trong tủ ủ lắc ở 30oC trong 5 ngày theo bố trí thí nghiệm.

Các yếu tố được giữ cố định: nhiệt độ môi trường (30-32oC); loại vi sinh vật lên men và mật số giống chủng dựa vào kết quả thí nghiệm trên.

- Theo dõi các chỉ tiêu: Nồng độ glucose còn lại, pH và xác định nồng độ ethanol (ở 20oC) sau lên men. Kết quả phân tích phương sai và LSD của tất cả số liệu được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion phiên bản XV.

3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình lên men ethanol

a. Mục đích: Xác định nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên men.

b. Tiến hành

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại: nhiệt độ lên men có 3 mức độ: 25oC, 30-32oC và 37oC; thời gian lên men có 3 mức độ: 3, 5, 7 và 9 ngày. Tổng số nghiệm thức: 3 x 4 = 12 nghiệm thức. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 12 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 36 ĐVTN.

- Tiến hành: cho vào bình tam giác 100 mL dịch vỏ ca cao được thủy phân với pH thích hợp ở thí nghiệm trước. Thanh trùng bằng NaHSO3 với nồng độ 140 mg/L trong 30 phút. Chủng giống nấm men với mật số đã khảo sát. Đậy kín bình bằng water-lock và tiến hành lên men ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian lên men theo bố trí thí nghiệm.

Nuôi cấy nấm men S. cerevisiae

Chủng nấm men này được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường YPD (5g/L yeast extract, 10 g/L peptone, 20 g/L glucose) trong khoảng từ 1-2 ngày ở 30oC (Ausubel, 1994). Sau đó, chủng nấm được chuyển sang nuôi cấy trong bình nuôi cấy 100 mL chứa môi trường YPD lỏng. Bình nuôi cấy được giữ ổn định ở 30oC trong tủ ủ và được lắc liên tục trong 24 giờ với tốc độ 150 rpm. Mật số nấm men cần đạt sau quá trình nuôi cấy: khoảng 105-108 tế bào/mL.

3.3.4. Thử nghiệm sản xuất

Mục đích: Thử nghiệm sản xuất ethanol trên quy mô 500 mL và 1L đồng thời phân tích hiệu quả kinh tế của toàn bộ nghiên cứu.

Tiến hành: Thử nghiệm lên men dịch thủy phân ở quy mô 200 mL, 500 mL và 1000 mL.

Kết quả: Xác định được hiệu suất sản sinh ethanol khi tiến hành với quy mô 200 mL, 500 mL và 1000 mL.

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Ảnh hưởng của loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol ethanol

Thí nghiệm được tiến hành để đánh giá khả năng lên men ethanol của 4 chủng nấm men (YB3K, VVĐ3, BKĐ4 và 2.1) với 4 mức độ mật số giống chủng (102, 104, 106 và 107 tế bào/mL) tương ứng từng chủng.

Bảng 3. Ảnh hưởng của loại nấm men đến quá trình lên men ethanol

STT Loại nấm men Ethanol sinh ra (% v/v)

Hiệu suất tiêu thụ glucose (%)

1 YB3K 2,76c 93,96c

2 VVĐ3 3,28a 94,99a

3 2.1 3,05b 94,60b

4 BKĐ4 2,40d 93,61d

Ghi chú: Các giá trị là trung bình của 12 lần lặp lại; trong cùng một cột, các giá trị có cùng chữ thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.

Kết quả thống kê từng nhân tố cho thấy ảnh hưởng của loại nấm men đến hàm lượng ethanol sinh ra là có ý nghĩa (ở mức độ tin cậy 95%). Dựa vào Bảng 3, chủng VVĐ3 cho hiệu suất tạo thành ethanol cao nhất (trung bình 3,28% v/v) sau 5 ngày lên men. Bên cạnh đó, lượng glucose còn lại sau lên men bởi chủng này là thấp nhất (0,3% w/v-Phụ lục 4). Điều này chứng tỏ chủng S. cerevisiae VVĐ3 có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt hơn 3 chủng còn lại. Trong 4 chủng được khảo sát, hiệu suất sản sinh ethanol và hiệu suất tiêu thụ glucose của chủng BKĐ4 đạt thấp nhất chứng tỏ sự phát triển của chủng này trên môi trường dịch thủy phân đạt kém. Điều này có thể là do sự không tương thích với một số chất sản sinh từ quá trình thủy phân bằng acid hoặc do đặc tính sinh học của nó không thích nghi tốt với môi trường có lượng đường khử thấp.

Bảng 4. Ảnh hưởng của mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol

STT Mật số

giống chủng Ethanol sinh ra (% v/v)

Hiệu suất tiêu thụ glucose (%)

1 102 1,59d 93,38d

2 104 2,34c 94,15c

3 106 4,00a 94,64b

4 107 3,55b 95,00a

khi tăng mật số nấm men ban đầu trong một khoảng giá trị từ 102-106 tế bào/mL, nồng độ ethanol sinh ra và hiệu suất tiêu thụ glucose cũng tăng. Khi mật số nấm men đạt 106, lượng ethanol sinh ra cao nhất (4% v/v), trong khi đó các nghiệm thức lên men với mật số thấp hơn cho kết quả độ cồn thấp hơn (khoảng 1,59-3,55% v/v). Vấn đề trên có thể được giải thích rằng do hệ khảo sát là hệ kín nên mật số giống chủng càng thấp thì nấm men càng dành nhiều thời gian và dinh dưỡng hơn cho pha sinh trưởng (Galazzo và Bailey, 1990), quá trình lên men diễn ra không triệt để khi mật số giống chủng nhỏ hơn 106 tế bào/mL. Tuy nhiên, khi mật số giống chủng tăng lên 107 tế bào/mL, lượng ethanol sinh ra giảm mặc dù hiệu suất tiêu thụ glucose tăng. Điều này được giải thích là khi tỷ lệ nấm men bổ sung càng cao thì tốc độ lên men ở thời gian đầu càng nhanh và có thể cản trở quá trình lên men tiếp theo (Lương Đức Phẩm, 2009).

Bảng 5. Ảnh hưởng của loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol

STT

Nhân tố Chỉ tiêu theo dõi

Chủng nấm men Mật số (tế bào/mL) Ethanol sinh ra (% v/v) ở 20oC

Hiệu suất tiêu thụ glucose (%) 1 YB3K 102 1,55 j 92,93 jk 2 YB3K 104 2,22 h 94,02 fgh 3 YB3K 106 3,86 c 94,32 efg 4 YB3K 107 3,39 d 94,59 de 5 VVĐ3 102 1,65 j 94,34 efg 6 VVĐ3 104 2,73 f 94,79 cde 7 VVĐ3 106 4,70 a 95,29 abc 8 VVĐ3 107 4,03 c 95,53 a 9 2.1 102 1,51 j 93,56 hi 10 2.1 104 2,49 g 94,55 def 11 2.1 106 4,27 b 94,95 bcd 12 2.1 107 3,93 c 95,35 ab 13 BKĐ4 102 1,64 j 92,68 k 14 BKĐ4 104 1,92 i 93,24 ij 15 BKĐ4 106 3,18 e 93,98 gh 16 BKĐ4 107 2,86 f 94,55 def

Ghi chú: Xét theo từng chỉ tiêu: các giá trị có cùng chữ thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (ở mức độ tin cậy 95%).

Kết quả tương tác ảnh hưởng của 2 nhân tố loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men được thể hiện trong Bảng 5. Tuy hiệu suất tiêu thụ glucose ở cả 4 chủng đều tăng theo chiều tăng của mật số, nhưng nồng độ ethanol sinh ra ở các nghiệm thức lại thay đổi không theo quy luật này. Nhìn chung, khi mật số ban đầu là 102 tế bào/mL, hàm lượng ethanol sinh ra bởi 4 chủng nấm men thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Trường hợp này được giải thích rằng mật số giống chủng quá thấp, khả năng nẩy chồi tiếp và thời gian đạt được định mức là rất dài ảnh hưởng đến hoạt động và trao đổi chất của nấm men. Quá trình lên men này thường cho hiệu quả kém (Lương Đức Phẩm, 2009). Khi mật số tăng lên 104 và 106 tế bào/mL, khả năng lên men tạo ethanol của 4 chủng nấm men có sự khác biệt về mặt thống kê. Trong khoảng mật số này, khả năng tạo thành ethanol của chủng VVĐ3 luôn đạt cao hơn 3 chủng còn lại và đạt cực đại (4,7% v/v) khi chủng nấm men là VVĐ3 và mật số 106 tế bào/mL. Tuy nhiên, sự giảm nồng độ ethanol tạo thành khi mật số giống chủng tăng lên thành 107 tế bào/mL đã được ghi nhận ở cả 4 chủng nấm men. Điều này phù hợp với mục 4.1, theo đó phần lớn glucose đã được sử dụng để gia tăng sinh khối thay vì sản sinh ethanol.

Như vậy, điều kiện thích hợp cho quá trình lên men ethanol là chủng nấm men VVĐ3 với mật số giống chủng là 106 tế bào/mL; điều kiện này được áp dụng cho toàn bộ quá trình lên men sau này.

4.2. Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu và pH ban đầu đến quá trình lên

men ethanol

Thí nghiệm này khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu (7, 6, 5 và 4% w/v) và pH ban đầu (4,5; 5; 5,5 và 6) đối với quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân vỏ trái ca cao bằng chủng nấm men VVĐ3.

Kết quả thống kê từng nhân tố cho thấy ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu đến hàm lượng ethanol sinh ra là có ý nghĩa (ở mức độ tin cậy 95%). Theo Lương Đức Phẩm (2009), trong quá trình lên men ethanol, glucose đóng một vai trò rất quan trọng; nó là một loại đường lý tưởng cung cấp nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men. Theo Bảng 6, hàm lượng ethanol tạo thành giảm theo chiều giảm nồng độ glucose ban đầu trong khoảng giá trị khảo sát. Ở nồng độ glucose ban

chất dinh dưỡng không đủ cho quá trình tăng sinh khối nấm men, dẫn đến việc nấm men có thể bị chết do cạnh tranh dinh dưỡng lẫn nhau (Trumbly, 1992).

Bảng 6. Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu đến hàm lượng ethanol sinh ra

Nồng độ glucose ban đầu (% w/v)

Chỉ tiêu theo dõi Ethanol sinh ra (% v/v) ở 20oC pH sau lên men Hiệu suất tiêu thụ glucose (%) 4 1,76 d 4,90 b 92,74 d 5 2,56 c 4,91 b 93,81 c 6 3,03 b 4,97 a 94,79 b 7 3,56 a 4,68 c 95,66 a

Ghi chú: Xét theo từng chỉ tiêu: những chữ cái giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (ở mức độ tin cậy 95%).

Kết quả phân tích thống kê theo từng nhân tố cho thấy ảnh hưởng của pH đến sự thay đổi hiệu suất lên men ethanol là có ý nghĩa (ở mức độ tin cậy 95%). Theo Pampulha et al. (1989), pH có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của nấm men, có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng và chiều hướng lên men. Nếu pH trong khoảng 4,5-5,5 thì quá trình lên men ethanol diễn ra bình thường. Do thí nghiệm này chỉ kiểm soát pH ban đầu nên sau một thời gian lên men nhất định, có thể thấy pH của dịch lên men giảm xuống. Sự thay đổi này là do nấm men đã sử dụng đường trong môi trường, đồng thời sản sinh ra CO2 và một số acid hữu cơ (Lương Đức Phẩm, 2009). Cụ thể, đối với pH ban đầu là 4,5, phù hợp cho nấm men phát triển, nhưng sau 5 ngày, khả năng đó giảm dần. Ở pH ban đầu bằng 6, lớn hơn 0,5 đơn vị so với mức tối ưu, khả năng sinh trưởng và hình thành ethanol đạt thấp hơn các khoảng pH còn lại. Sau 5 ngày, pH dịch lên men giảm xuống còn 5,55, tuy nhiên do dinh dưỡng trong môi trường đã gần hết (glucose còn lại chỉ khoảng 0,3% w/v-phụ lục 4.4) nên quá trình lên men cũng đạt hiệu quả không cao. Đối với các nghiệm thức có pH ban đầu là 5 và 5,5, mặc dù pH có giảm xuống tương ứng còn 4,54 và 5,11 nhưng vẫn nằm trong khoảng tối ưu nên sự giảm này không ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng, do vậy lượng ethanol tạo thành và hiệu suất tiêu thụ glucose cao hơn các nghiệm thức còn lại.

Bảng 7. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hàm lượng ethanol sinh ra

pH ban đầu

Chỉ tiêu theo dõi Ethanol sinh ra (% v/v) ở 20oC pH sau lên men Hiệu suất tiêu thụ glucose (%) 4,5 2,30 c 4,26 d 93,86 b 5,0 3,32 b 4,54 c 94,16 b 5,5 3,64 a 5,11 b 95,09 a 6,0 1,64 d 5,55 a 93,88 b

Ghi chú: Xét theo từng chỉ tiêu: trong cùng một cột, những chữ cái giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (ở mức độ tin cậy 95%).

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose và pH ban đầu đến lượng ethanol sinh ra, pH sau lên men và hiệu suất tiêu thụ glucose được thể hiện trong bảng 8.

Bảng 8. Ảnh hưởng tương tác giữa nồng độ glucose và pH ban đầu đến quá trình lên men ethanol

STT

Nhân tố Chỉ tiêu theo dõi

Glucose ban

đầu (% w/v) pH ban đầu Ethanol sinh ra (% v/v) ở 20oC

pH sau lên men Hiệu suất tiêu thụ glucose (%) 1 4 4,5 1,62 m 4,25 l 92,77 g 2 4 5,0 2,29 h 4,57 i 93,17 fg 3 4 5,5 2,37 h 5,22 f 93,43 efg 4 4 6,0 0,76 n 5,56 c 91,58 h 5 5 4,5 2,04 j 4,22 m 93,46 efg 6 5 5,0 3,02 f 4,57 i 93,66 efg 7 5 5,5 3,43 e 5,26 e 94,31 cde 8 5 6,0 1,75 l 5,6 b 93,81 ef 9 6 4,5 2,58 g 4,25 l 94,04 def 10 6 5,0 3,63 d 4,67 h 94,25 cde 11 6 5,5 4,04 c 5,26 e 95,88 ab 12 6 6,0 1,89 k 5,68 a 95,01 bcd 13 7 4,5 2,99 f 4,32 k 95,18 bc 14 7 5,0 4,35 b 4,34 j 95,57 b