ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS, COLIFORMS CHỊU NHIỆT, E COLI GIẢ ĐỊNH VÀ E.

COLI TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN.

Phương pỏhp này được ỏp dụng để định lượng cỏc vi sinh vật với mật độ thấp trong cỏc mẫu thực phẩm.

15.1 Định nghĩa

Trong phương phỏp này, Coliforms được hiểu là những vi sinh vật sinh hơi trong mụi trường canh Lauryl Sulphate Broth và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt broth, nuụi ủ ở 37oC trong khoảng thời gian 48 giờ. Coliforms chịu nhiệt là những vi sinh vật sinh hơi trong mụi trường canh EC nuụi ủ ở 44. trong thời gian 24 giờ. Coliforms phõn (E. coli giả định) là Coliforms chịu

nhiệt sinh indole trong canh trypton nuụi ủ ở 44.5oC trong khoảng 24 giờ. E.coli là Coliforms phõn cho kết quả theo nghiệm phỏp IMViC là ++ - -

15.2 Nguyờn tắc

Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, E.coli giả định (Coliforms phõn) và E.coli được xỏc định bằng phương phỏp MPN, phương phỏp này dựa vào nguyờn tắc mẫu được pha loóng thành một dóy thập phõn (hai nồng độ kế tiếp chờnh nhau 10 lần) và đưa vào cỏc ống nghiệm cú chứa mụi trường thớch hợp, ủ và đọc số ống cho kết quả dương tớnh. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tớnh của cỏc nồng độ pha loóng được tra theo bảng MPN để xỏc định tổng số Coliforms trong 1 gam (hoặc 1 ml) sản phẩm.

15.3 Mụi trường và thuốc thử

Canh Lauryl sulphate (sodium dodecyl sulphate - LSB) Canh Brilliant green lactose bile salt (BGBL)

Canh EC (E.coli medium)

(Cỏc mụi trường canh trờn được chuẩn bị trong cỏc ống nghiệm, cú ống durham ngược, chỉ sử dụng cỏc ống khi khụng cũn bọt khớ đọng trong cỏc ống durham)

Canh Tryptone Thuốc thử Kovac’s Canh MR-VP

Thuốc thử Methyl red. Thuốc thử Alpha napthol. Thạch Simmon citrate

(Xem phương phỏp chuẩn bị cỏc mụi trường thuốc thử trờn ở phương phỏp định lượng coliform, E.coli )

15.4 Cỏc thiết bị chớnh

Bể điều nhiệt 44oC ± 0.5 oC Tủ ấm 37.oC ±1.0oC

15.5 Qui trỡnh cấy mẫu và đọc kết quả

Coliforms: Cấy 1 ml dịch mẫu đó pha loóng 1:10 vào dóy 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10

ml canh Lauryl sulphate. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đó pha loóng 1:100 và 1:1000. Nếu nghi ngờ lượng vi sinh vật trong mẫu quỏ cao, phải tăng độ pha loóng mẫu. U ở 37.0oc + 10C/48 giờ. Ghi nhận số ống cú sinh hơi. Dựng khuyờn cấy cấy chuyển dịch mẫu từ cỏc ống LSB dương tớnh sang cỏc ống cú chứa canh Brilliant green lactose bile salt. ủ ở 37.0oC±1.oC trong thời gian 48 giờ. Ghi nhận số ống cú sinh hơi. Đọc số lượng cỏc ống cho kết quả dương tớnh. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tớnh của cỏc nồng độ pha loóng được tra theo bảng MPN để xỏc định tổng số Coliforms trong 1g (hoặc 1 ml) sản phẩm.

Coliforms chịu nhiệt

Dựng khuyờn cấy cấy chuyển dịch mẫu từ cỏc ống canh Lauryl sulphate cú sinh hơi sang mụi trường canh EC, ủ ở 44.5oC ±0.2 oC trong thời gian 24 giờ. Đếm số lượng cỏc ống cho kết quả dương tớnh. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tớnh của cỏc nồng độ pha loóng được tra theo bảng MPN để xỏc định tổng số Coliforms chịu nhiệt trong 1 g (hoặc 1 ml) sản phẩm.

Coliforms phõn

Dựng khuyờn cấy vũng cấy chuyền từ cỏc ống cú sinh hơi trờn mụi trường canh EC sang mụi trường thạch đĩa EMB. U cỏc đĩa này ở 37oC trong thời gian 24 giờ. Chọn cỏc khuẩn lạc trũn,

dẹt cú hỡnh đĩa và cú ỏnh kim tớm, đường kớnh khoảng lớn hơn 1mm. Cỏc khuẩn lạc nghi ngờ này được cấy chuyển vào mụi trường canh Trypton, ủ ở 44.5oC± 0.2oC trong khoảng 24 giờ. Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào cỏc ống nghiệm đó ủ. Phản ứng dương tớnh khi cú màu đỏ xuất hiện trong mụi trường trong vũng vài phỳt. Đọc số lượng cỏc ống cho kết quả dương tớnh. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tớnh của cỏc nồng độ pha loóng được tra theo bảng MPN để xỏc định tổng số Coliforms phõn trong 1g (hoặc 1 ml) sản phẩm.

E. coli

Dựng khuyờn cấy phõn lập chuyển dịch mẫu từ cỏc ống cú sinh hơi trờn mụi trường canh EC sang mụi trường thạch đĩa EMB. U cỏc đĩa này ở 37oC trong thời gian 24 giờ. Chọn cỏc khuẩn lạc trũn, dẹt cú hỡnh đĩa và cú ỏnh kim tớm, đường kớnh khoảng lớn hơn 1mm. Cỏc khuẩn lạc nghi ngờ này được cấy chuyển vào mụi trường canh Trypton, ủ ở 44.5oC± 0.2oC trong khoảng 24 giờ đồng thời cấy vào cỏc mụi trường MRVP, simmoncitrate agar để thực hiện cỏc phản ứng trong nghiệm phỏp IMViC

E.coli được xỏc định khi nghiệm phỏp IMViC cho kết quả phự hợp (++ - -). Đếm số lượng cỏc ống cho kết quả IMViC ++ - - từ cỏc đĩa cho cỏc khuẩn lạc nghi ngờ. Số ống nghiệm cho kết quả IMViC phự hợp của cỏc nồng độ pha loóng được tra theo bảng MPN để xỏc định tổng số

E.coli trong 1 g (hoặc 1 ml) sản phẩm.

15.6 Biểu diễn kết quả

Số lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, E. coli giả định và E. coli được biểu diễn với đơn vị MPN/g (ml). Trong trường hợp nồng độ cấy vào dóy đầu tiờn cú sự pha loóng nhỏ hơn 10-1