Nguyên tắc:
Ở nhiệt độ cao, dƣới tác dụng của H2SO4 đậm đặc và có chất xúc tác, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa, carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O, còn gốc amin thì bị oxy hóa và giải phóng ra NH3, NH3 tác dụng với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4tan trong dung dịch. Đây là giai đoạn công phá đạm trong mẫu.
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
Trong quá trình chƣng cất, (NH4)2SO4 tác dụng với NaOH dƣ và giải phóng ra NH3
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + H2O
Amonia sinh ra sẽ đƣợc hấp thụ bằng dung dịch axit boric tạo thành tetraborat amon. Sau đó chuẩn độ dung dịch tetraborat amon bằng dung dịch chuẩn H2SO4, NH3 đƣợc giải phóng và xác định đƣợc lƣợng nitơ, theo các phản ứng sau:
NH3 + H2O → NH4OH + H+
2NH4OH + 4H3BO4 → (NH4)2B4O7 + 7H2O (NH4)2B4O7 + H2SO4 +5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO4
Tính đƣợc % nitơ có trong mẫu nhân với 6.25 sẽ suy ra đƣợc % protein thô. Chỉ số này tùy thuộc vào tỉ lệ của các hợp chất nitơ có trong protein, nói cách khác tùy thuộc vào nguồn gốc của protein (ví dụ: protein trong sữa: 6.38; ngũ cốc: 5.9; gelatin: 5.55; hạt có dầu: 5.4). Tuy nhiên, ngƣời ta thƣờng dùng chỉ số chung là 6.25.
Các bước tiến hành: 1. Công phá đạm:
- Cân 0.25g mẫu cho vào ống nghiệm Kjeldal, đặt ống vào trong kệ nhôm. - Cho vào ống lần lƣợt 10ml H2O2 và 10ml H2SO4 đậm đặc, để yên 5 phút. - Đặt cả kệ nhôm vào trong bộ phận công phá đạm. Mở vòi nƣớc và bật máy. Chỉnh nhiệt độ ở 4 mức:
1100C trong 20 phút 2000C trong 20 phút 3000C trong 20 phút 3700C trong 20 phút
- Tắt máy, khoảng 10 phút sau, tắt nƣớc, lấy kệ đỡ ra và chờ nguội hẳn. Nếu dung dịch trong ống nghiệm có màu trắng là quá trình công phá đạm xảy ra hoàn toàn, nếu còn màu vàng thì thêm 5ml H2O2 và lặp lại bƣớc 3.
2. Chưng cất
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 32 Lê Văn Vệ - Đặt ống nghiệm chứa dung dịch (NH4)2SO4 đã công phá đạm vào đúng vị trí ở hệ thống chƣng cất đạm.
- Bên dƣới hệ thống chƣng cất, đặt bình tam giác chứa 10ml dung dịch axit boric 2%.
- Bật máy, đợi khi xuất hiện chữ P thì bấm nút RUN.
- Máy chạy khoảng 5 phút, khi xuất hiện chữ “END” thì tắt. Dung dịch trong bình tam giác lúc này có màu xanh.
3. Chuẩn độ
Cho từng giọt dung dịch H2SO4 0.1N từ ống buret vào bình tam giác và lắc đều, nhẹ đến khi dung dịch vừa chuyển sang màu hồng nhạt thì dừng lại. Ghi thể tích dung dịch 0.1N H2SO4 vừa chuẩn độ. Cách tính: % N = * 100 % * 0014 . 0 * ) V ( 0 Dr m V %CP = %N * 6.25 (%CP: % protein thô) Trong đó:
Vo: Thể tích H2SO4 0.1N chuẩn độ mẫu không
V: Thể tích H2SO4 0.1N chuẩn độ mẫu đang phân tích m: Trọng lƣợng mẫu (g)
%Dr: % độ khô (= 100% - độ ẩm%)
0.0014: số g nitơ ứng với 1ml H2SO4 0.1N dùng chuẩn độ