Nguyên tắc:
Dung môi chứa trong bình cầu (Chloroform) đƣợc đun nóng bay hơi lên và nhờ hệ thống làm lạnh nó ngƣng tụ nhỏ giọt xuống thấm qua ống len đựng mẫu và hòa tan các chất béo tự do có trong mẫu. Quá trình này đƣợc lặp lại 15 - 20 lần, tất cả các chất béo đƣợc trích ly ra khỏi mẫu. Sản phẩm thu đƣợc trong bình cầu là dung môi và các chất béo.
Các bước tiến hành:
- Sấy bình cầu 100 ml ở nhiệt độ 1050C trong 2 giờ. Sau 2 giờ đặt bình cầu vào bình hút ẩm khoảng 10 phút. Cân bình cầu sau khi sấy (W1).
- Cân 2 - 6g mẫu cần phân tích cho vào ống len đã đƣợc sấy khô (Wm). - Đong 90 - 100 ml chloroform cho vào bình cầu.
- Đặt ống len có mẫu và bình cầu vào đúng vị trí.
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 33 Lê Văn Vệ - Sau 2 - 3 giờ (15 - 20 lần lặp lại), đổ chloroform ra, cho bình cầu vào hệ thống chạy một lần nữa đợi bình cầu cạn hết chloroform. Tắt máy, lấy bình cầu chứa mỡ ra khỏi hệ thống.
- Sấy bình cầu có mỡ trong 2-3 giờ, ở nhiệt độ 700C. Cân bình cầu sau khi sấy (W2). Cách tính: % Lipid = *100 % * ) ( 2 1 Dr W W W m (mẫu khô) Hoặc % Lipid = ( 2 1) *100 m W W W (mẫu ƣớt) Trong đó: Wm: Khối lƣợng mẫu. W1: Khối lƣợng bình cầu.
W2: Khối lƣợng mẫu và bình cầu sau sấy.
1.4 Phƣơng pháp phân tích ẩm độ
Nguyên tắc:
Mẫu đƣợc cân và cho vào trong một cốc sứ (hoặc cốc nhôm) đã biết trọng lƣợng, đặt cốc vào trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C đến khi trọng lƣợng ổn định (khoảng 24 giờ). Chênh lệch trọng lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy chính là độ ẩm.
Dụng cụ và thiết bị: - Tủ sấy - Cốc nhôm - Kẹp - Cân phân tích Các bước tiến hành:
1. Sấy cốc ở 1050C trong 2 giờ. Cân trọng lƣợng cốc (T).
2. Cân khoảng 2-3g mẫu cho vào cốc. Ghi trọng lƣợng của mẫu và cốc (W1).
3. Đặt cốc vào trong tủ sấy ở 1050C đến khi trọng lƣợng không thay đổi (khoảng 4-5 giờ đối với mẫu khô, 24 giờ đối với mẫu ƣớt).
4. Tắt tủ sấy, chờ 10-20 phút sau lấy cốc ra cân (W2). Cách tính:
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 34 Lê Văn Vệ Trọng lƣợng mẫu ƣớt: mW= W1-T
Trọng lƣợng mẫu khô: md=W2-T % Độ ẩm = (mw- md)/mw*100
Ghi chú:
Khi lấy mẫu (hoặc cốc) từ tủ sấy ra cân, mẫu phải đƣợc đặt trong bình hút ẩm.
1.5 Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng tro
Nguyên tắc:
Khi đốt và nung mẫu ở nhiệt độ rất cao, các chất hữu cơ có trong mẫu sẽ bị oxy hóa thành những chất bay hơi CO2, N2 và hơi nƣớc, phần vô cơ còn lại chính là tro. Quá trình này hoàn tất khi mẫu có màu trằng hoặc xám.
Dụng cụ và thiết bị: - Bếp đốt điện (250 đến 270OC) - Tủ nung - Tủ sấy - Cốc xứ (cốc nhôm) - Kẹp - Cân phân tích Các bước tiến hành:
1. Lấy cốc chứa mẫu khô sau khi phân tích ẩm độ đặt lên bếp điện đốt ở nhiệt độ cao 250 đến 270OC đến khi không còn thấy khói.
2. Cho cốc vào trong tủ nung, mở nhiệt độ 560OC trong 4 giờ (đến khi mẫu có mẫu có màu trắng hoặc xám).
3. Tắt tủ nung khoảng 30 phút để cho nhiệt độ hạ xuống mới lấy mẫu ra và đem cân (W3).
Cách tính: % Tro = 100 d 3 m T W
1.6 Phƣơng pháp phân tích vi sinh tổng số
Nguyên tắc:
Đồng nhất mẫu với dịch pha loãng. Từ dung dịch mẫu sau khi đồng nhất, tiến hành pha loãng thập phân thành nhiều nồng độ. Ở mỗi nồng độ thích hợp, chuyển 1ml dịch mẫu đã pha loãng vào đĩa Petri, sau đó trộn đều mẫu với môi trƣờng thạch không chọn lọc.
Ủ mẫu trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ và thời gian theo yêu cầu. Sau đó, tính số vi sinh vật hiếu khí phát hiện đƣợc trên 1 gam mẫu.
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 35 Lê Văn Vệ Quy trình phân tích :
Chuẩn bị mẫu :
Cân 1gam mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 9ml dịch pha loãng SPW. Đồng nhất mẫu trong khoảng 1 phút tùy theo đặc điểm của mẫu. Dịch mẫu sau đồng nhất có nồng độ là 10-1. Tiếp tục pha loãng thập phân với SPW đến nồng độ thích hợp.
Cấy mẫu:
Chuyển 1.0 ml ở mỗi nồng độ thích hợp vào đĩa Petri vô trùng ( mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa). Tiếp theo cho vào mỗi đĩa khoảng 15-20ml môi trƣờng PCA ở nhiệt độ 450C. Trộn đều dịch mẫu và môi trƣờng bằng cách di chuyển đĩa theo hình số 8 phải đảm bảo rằng mẫu và môi trƣờng đƣợc trộn đều.
Ủ đĩa:
Lật ngƣợc các đĩa Petri, ủ trong tủ ủ 300C10C trong thời gian 726 giờ. Tính kết quả
Nếu chỉ có một nồng độ cho khoảng đếm thích hợp, tính số đếm trung bình từ hai đĩa của nồng độ đó và ghi nhận kết quả nhƣ tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Nếu 2 đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25-250, việc tính kết quả dựa trên NMKL report no5.
Số lƣợng N vi khuẩn có trong mẫu thử đƣợc tính theo phƣơng trình sau: N = d n n V C ) 1 . 0 ( 1 2 Trong đó:
Clà tổng số khuẩn lạc trên các đĩa ở 2 độ pha loãng kế tiếp nếu các đĩa điều có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25-250
V là thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (ml) n1 là số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất.
n2 là số đĩa ở độ pha loãng thứ hai
d nồng độ tƣơng ứng với độ pha loãng thứ nhất.
Việc làm tròn số chỉ lấy hai chữ số có ý nghĩa, chỉ áp dụng trong trƣờng hợp xác định vi sinh vật hiếu khí. Khi làm tròn số, nâng chữ số thứ hai lên số có giá trị cao hơn khi số thứ ba lớn hơn hoặc bằng 5 và thay các số lẻ bằng số 0. Nếu chữ số thứ ba nhỏ hơn hoặc bằng 4, thay nó bằng số không và giữ nguyên số thứ hai.
Đối với những trƣờng hợp bất thƣờng (không đĩa nào trong cặp đĩa hoặc chỉ một đĩa có số đếm thích hợp…) có thể đếm và ghi nhận kết quả theo hƣớng dẫn sau (FDA - 1984)
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 36 Lê Văn Vệ Đếm số khuẩn lạc thực có trên mỗi đĩa cấy cùng nồng độ đó, tính số khuẩn lạc trung bình cho mỗi đĩa và nhân với số lần pha loãng để có đƣợc ƣớc định của tổng số vi sinh vật hiếu khí. Đánh dấu kết quả bằng dấu (*) để biết rằng đó là kết quả ƣớc định tính từ những đĩa nằm ngoài ngƣỡng 25 - 250.
Hai đĩa có số đếm trên 250:
Đếm số khuẩn lạc trên vài vùng đại diện cho số khuẩn lạc của đĩa (1/4, 1/6… diện tích đĩa) rồi qui ra cho diện tích toàn đĩa. Giá trị trung bình của hai đĩa đƣợc ghi nhận nhƣ tổng số vi sinh vật hiếu khí ƣớc định. Đánh dấu (*) để biết rằng đây là kết quả ƣớc định tính từ những đĩa nằm ngoài ngƣỡng 25 - 250.
Dạng mọc lan
Các dạng mọc lan thƣờng thuộc ba loại khác nhau.
(1) Một chuỗi khuẩn lạc không tách rời hẳn khỏi nhau nhƣ đƣợc tạo nên bởi sự phân tách của một cụm vi sinh vật.
(2) Dạng mọc lan trong lớp nƣớc mỏng giữa thạch và đáy đĩa. (3) Dạng mọc lan trong lớp nƣớc mỏng ở rìa hoặc trên mặt thạch.
Nếu các đĩa cấy có dạng mọc lan phát triển nhiều đến mức: a) vùng mọc lan (kể cả vùng mà sự phát triển bị kìm hãm) vƣợt quá 50% diện tích đĩa: hoặc b) vùng mà sự phát triển bị kìm hãm vƣợt quá 25% diện tích đĩa đều đƣợc ghi nhận là đĩa mọc lan. Xác định số đếm trung bình cho mỗi nồng độ, ghi nhận trung bình số học của các giá trị này nhƣ tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Khi cần phải đếm những đĩa chứa dạng mọc lan không bị loại bởi kiểu a và b nói trên, đếm mỗi dạng mọc lan thuộc 3 kiểu trên nhƣ từ một nguồn. Đối với kiểu 1, nếu chỉ 1 chuỗi thì đếm nhƣ 1 khuẩn lạc đơn. Nếu có 1 hay vài chuỗi có vẻ nhƣ phát triển từ những nguồn khác nhau thì đếm mỗi nguồn nhƣ 1 khuẩn lạc riêng biệt. Không đƣợc đếm mỗi nhóm sinh trƣởng riêng biệt trong một chuỗi kiểu này nhƣ một khuẩn lạc tách rời. Dạng 2 và 3 thƣờng sinh ra những khuẩn lạc tác rời và đƣợc đếm nhƣ những khuẩn lạc riêng biệt. Kết hợp các số đếm từ dạng mọc lan và số đếm khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Đĩa không có khuẩn lạc
Khi trên các đĩa từ mọi nồng độ pha loãng đều không có khuẩn lạc nào, ghi kết quả tổng số vi sinh vật ít hơn 1 lần nồng độ pha loãng thấp nhất đã đƣợc sử dụng. Đánh dấu (*) để biết kết quả này là ƣớc định do số đếm nằm ngoài ngƣỡng 25 - 250.
Một đĩa thuộc khoảng 25 - 250, đĩa thứ hai quá 250
Đếm cả 2 đĩa, dung cả kết quả đĩa có số khuẩn lạc quá 250 để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 37 Lê Văn Vệ Hai nồng độ đếm đƣợc, mỗi nồng độ 1 đĩa nằm ngoài ngƣỡng 25 - 250
Khi 1 đĩa của 1 nồng độ nằm trong ngƣỡng 25 - 250, đĩa thứ hai có dƣới 25 hoặc 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng cả 4 số đếm để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm đƣợc, một nồng độ có 2 đĩa trong ngƣỡng, một nồng độ chỉ có 1 đĩa trong ngƣỡng 25 - 250
Khi cả 2 đĩa của 1 nồng độ chứa 25 - 250 khuẩn lạc và chỉ 1 đĩa của nồng độ khác chứa 25 - 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng kết quả của cả đĩa dƣới 25 lần đĩa trên 250 khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 38 Lê Văn Vệ
PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ THỐNG KÊ
Bảng P2.1 Kết quả thống kê Duncan điểm trung bình có trọng lƣợng cắt khúc
Descriptives
DTBCTL
N Mean
Std.
Deviation Std. Error
95% Confidence Interval for Mean
Minimum Maximum
Lower Bound Upper Bound
1 3 14.8033 .35529 .20513 13.9207 15.6859 14.40 15.07 2 3 16.4800 .41869 .24173 15.4399 17.5201 16.00 16.77 3 3 18.3167 .41187 .23779 17.2935 19.3398 17.86 18.66 Total 9 16.5333 1.56006 .52002 15.3342 17.7325 14.40 18.66 ANOVA DTBCTL
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 18.528 2 9.264 58.986 .000 Within Groups .942 6 .157 Total 19.470 8 DTBCTL Duncan NT N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3
1 3 14.8033
2 3 16.4800
3 3 18.3167
Sig. 1.000 1.000 1.000
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 39 Lê Văn Vệ Bảng P2.2 Kết quả thống kê Duncan điểm trung bình có trọng lựong thí nghiệm hấp
Descriptives
DTBCTL
N Mean
Std.
Deviation Std. Error
95% Confidence Interval for Mean
Minimum Maximum
Lower Bound Upper Bound
1 3 14.5933 .36116 .20851 13.6962 15.4905 14.37 15.01 2 3 15.3167 .23245 .13421 14.7392 15.8941 15.14 15.58 3 3 15.7033 .29400 .16974 14.9730 16.4337 15.46 16.03 4 3 15.9367 .45214 .26104 14.8135 17.0599 15.42 16.26 5 3 16.4267 .08021 .04631 16.2274 16.6259 16.35 16.51 6 3 16.3067 .25775 .14881 15.6664 16.9469 16.03 16.54 7 3 16.4167 .28219 .16292 15.7157 17.1177 16.22 16.74 8 3 17.4700 .37242 .21502 16.5448 18.3952 17.18 17.89 9 3 15.2433 .46608 .26909 14.0855 16.4011 14.94 15.78 Total 27 15.9348 .85519 .16458 15.5965 16.2731 14.37 17.89 ANOVA DTBCTL
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 17.048 8 2.131 19.495 .000
Within Groups 1.968 18 .109
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 40 Lê Văn Vệ
DTBCTL
Duncan
NT N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3 4 5 1 3 14.5933 9 3 15.2433 2 3 15.3167 3 3 15.7033 15.7033 4 3 15.9367 15.9367 6 3 16.3067 7 3 16.4167 5 3 16.4267 8 3 17.4700 Sig. 1.000 .123 .399 .112 1.000
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 41 Lê Văn Vệ Bảng P2.3 Kết quả thống kê Duncan điểm trung bình có trọng lƣợng của tỷ lệ phối trộn gia vị nƣớc sốt cari Descriptives DTBCTL N Mean Std. Deviation Std. Error
95% Confidence Interval for Mean
Minimum Maximum
Lower Bound Upper Bound
1 3 11.6333 .33946 .19599 10.7901 12.4766 11.33 12.00 2 3 12.2767 .28919 .16697 11.5583 12.9951 11.95 12.50 3 3 11.9200 .35157 .20298 11.0467 12.7933 11.52 12.18 4 3 13.1100 .33181 .19157 12.2857 13.9343 12.80 13.46 5 3 14.1500 .45508 .26274 13.0195 15.2805 13.65 14.54 6 3 13.7133 .21548 .12441 13.1780 14.2486 13.49 13.92 7 3 14.7667 .44185 .25510 13.6690 15.8643 14.35 15.23 8 3 17.2267 .27592 .15930 16.5412 17.9121 17.02 17.54 9 3 15.2033 .49217 .28416 13.9807 16.4260 14.64 15.55 Total 27 13.7778 1.75181 .33714 13.0848 14.4708 11.33 17.54 ANOVA DTBCTL
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 77.391 8 9.674 72.572 .000
Within Groups 2.399 18 .133
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 42 Lê Văn Vệ
DTBCTL
Duncan
NT N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3 4 5 6 1 3 11.6333 3 3 11.9200 2 3 12.2767 4 3 13.1100 6 3 13.7133 13.7133 5 3 14.1500 14.1500 7 3 14.7667 14.7667 9 3 15.2033 8 3 17.2267 Sig. .055 .058 .160 .053 .160 1.000
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 43 Lê Văn Vệ Bảng P2.4. Kết quả thống kê Duncan điểm trung bình có trọng lƣợng của chế độ tiệt trùng Descriptives DTBCTL N Mean Std. Deviation Std. Error
95% Confidence Interval for Mean
Minimum Maximum
Lower Bound Upper Bound
1 3 14.4467 .23438 .13532 13.8644 15.0289 14.18 14.62 2 3 14.8533 .06429 .03712 14.6936 15.0130 14.78 14.90 3 3 15.2600 .35930 .20744 14.3674 16.1526 14.85 15.52 4 3 15.0533 .28290 .16333 14.3506 15.7561 14.75 15.31 5 3 18.1567 .21127 .12197 17.6319 18.6815 18.02 18.40 6 3 15.3100 .08000 .04619 15.1113 15.5087 15.23 15.39 7 3 15.0567 .28501 .16455 14.3487 15.7647 14.77 15.34 8 3 14.7633 .54857 .31672 13.4006 16.1261 14.13 15.09 9 3 14.5367 .29670 .17130 13.7996 15.2737 14.26 14.85 Total 27 15.2707 1.10589 .21283 14.8333 15.7082 14.13 18.40 ANOVA DTBCTL
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 30.219 8 3.777 43.064 .000
Within Groups 1.579 18 .088
GVHD: Đỗ Thị Thanh Hƣơng 44 Lê Văn Vệ
DTBCTL
Duncan
NT N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3 4 1 3 14.4467 9 3 14.5367 14.5367 8 3 14.7633 14.7633 14.7633 2 3 14.8533 14.8533 14.8533 4 3 15.0533 15.0533 7 3 15.0567 15.0567 3 3 15.2600 6 3 15.3100 5 3 18.1567 Sig. .139 .067 .058 1.000