Mẫu mô cá khi thu được cố định trong dung dịch NBF trong thời gian 24-48h. Sau đó chuyển sang ethanol 70%.
Cố định mẫu: Cố định mô cá trong dung dịch NBF từ 24 – 48 giờ. Sau đó chuyển mẫu sang cồn 70% và tiến hành xử lý mẫu.
Cắt tỉa và định hướng: Cắt mẫu mô cá thành từng lát dày 3-5 mm, sau đó cho vào casset và được xử lý trong máy tự động theo qui trình như bảng 3.2
Bảng 3.2: Qui trình xử lý mẫu trong máy tự động
Số thứ tự Hóa chất sử dụng Thời gian
1 Cồn 80% 20 phút 2 Cồn 95% 20 phút 3 Cồn 95% 30 phút 4 Cồn 100% 40 phút 5 Cồn 100% 40 phút 6 Cồn 100% 40 phút 7 Cồn 100% 60 phút 8 Xylen 20 phút 9 Xylen 30 phút 10 Paraffin+Xylen (7:3) 60 phút 11 Paraffin+ Sáp ong (1:1) 60 phút 12 Paraffin+ Sáp ong (7:3) 60 phút
Đúc khối: Mẫu được đúc khối bằng cách cho một ít paraffin vào khuôn inox. Sau đó cho mẫu vào khuôn, định hướng mẫu mô và để khuôn nhựa ở trên. Cho mẫu vào tủ lạnh để làm rắn khối paraffin.
Cắt lát: Mẫu được cắt thành lát có độ dày từ 1-2μm. Cho mẫu vào nước ở nhiệt độ 45-50oC, làm cho paraffin căng ra, dùng kim mũi giáo tách riêng từng đoạn theo yêu cầu trước khi dán vào lame.
Dán mẫu: Chọn lát cắt mẫu đạt yêu cầu dán vào phiến kính. Sau đó cho tiêu bản lên bàn sấy ở nhiệt độ 40oC khoảng 4 giờ và tiến hành nhuôm mẫu.
Bảng 3.3 Quy trình nhuộm mô.
STT Hóa chất sử dụng Thời gian
1 Xylen 5 phút 2 Xylen 5 phút 3 Xylen 5 phút 4 Cồn 100% 5 phút 5 Cồn 100% 5 phút 6 Cồn 70% 2 phút 7 Nước cất 5 phút 8 Haematoxylin 10 phút 9 Nước máy 5 phút
10 1% acid alcohol 10 giây
11 Nước máy 1 phút 12 Eosin 3 nhúng 13 Cồn 95% 5 phút 14 Cồn 100% 5 phút 15 Cồn 100% 5 phút 16 Xylen 5 phút 17 Xylen 5 phút
Dán lamelle: nhỏ keo Enterlan lên mẫu, đặt lamelle nghiên 1 góc 450 và tiếp xúc với giọt keo, hạ lamelle xuống từ từ để tránh bọt khí. Mục đích giúp bảo quản mẫu được lâu và tăng hiệu quả tính chiết quang của mẫu.
Đọc kết quả: quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính 10X. tiêu bản đạt yêu cầu thì có nhân bắt màu đậm của Hematoxylin, phần còn lại bắt màu của Eosin. Sau đó chuyển sang vật kính 40X hoặc 100X (nhỏ giọt dầu) chọn các tiêu bản đẹp và có dấu hiệu đặc trưng chụp hình.
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu cơ bản
Vi khuẩn sau khi được phục hồi trên môi trường BHIA + 1,5% NaCl được nhuộm Gram kiểm tra tính thuần. kết quả nhuộm gram cho thấy tất cả các vi khuẩn đều là gram (+) dạng liên cầu (Hình 4.1).
Hình 4.1 Kết quả nhuộm gram
Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa khác cho thấy vi khuẩn không di động, cho phản ứng catalase âm tính, oxidase âm tính, vi khuẩn không có khả năng sinh H2S, Nitrate âm tính và phản ứng O/F âm tính chứng tỏ rằng vi khuẩn không lên men và oxi hóa đường glucose (Bảng A, Phụ lục III).
Những kết quả thu được ở trên phù hợp với kết quả của Suanyuk et al.
(2010) khi kiểm tra vi khuẩn phân lập từ cá chẽm cho thấy vi khuẩn là gram (+) dạng liên cầu, catalase âm tính, oxidase âm tính, H2S âm tính, Indol âm tính, nitrate âm tính, O/F âm tính.
4.2 Kết quả kiểm tra bằng kít API 20 Strep
Vi khuẩn sau khi nhuộm Gram cho kết quả là hình cầu gram (+), catalase (-) được định danhvi khuẩn bằng bộ kit API 20 Strep. Từ kết quả định danh (Hình 4.3, Bảng C phụ lục III) xác định được 1 chủng vi khuẩn là
Streptococcus agalactiae, 15 chủng vi khuẩn còn lại là streptococcus iniae.
Điều này chứng minh rằng Streptococcis agalactiae cũng hiện diện ở nước
mặn. Suanyuk et al. (2010) sử dụng bộ kit API 20 Strep và Slidex Strepto-kit đã xác định được vi khuẩn phân lập từ cá chẽm bệnh là Streptococcus iniae và
Streptococcus agalactiae. Đều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của đề tài.
Ngoài ra, Yuasa et al. (2008) khi sử dụng bộ kit API 20 strep để định danh vi khuẩn phân lập từ cá rô phi ở Indonesia kết quả thu được là vi khuẩn
Streptococcus iniae. Qua đó cho thấy vi khuẩn Streptococcus gây bệnh trên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhiều đối tượng nuôi. Nawawi et al. (2008) đã kiểm tra vi khuẩn phân lập từ cá chẽm bằng bộ kit API 20 Strep và đã xác định vi khuẩn là Streptococcus
iniae.
Hình 4.3. Kết quả test API 20 Strep sau 4 giờ.
4.3 Kết quả kiểm tra NaCl 6,5 % và tan huyết
Qua kiểm tra 16 chủng vi khuẩn thì tất cả đều không phát triển ở trong môi trường có bổ sung NaCl 6,5% (Hình 4.5). Có 15/16 chủng có khả năng gây tan huyết trong đó 11 chủng (1 não 2a, 1 não 4, 2 thận 2, 2 não 2a, 2 não 2b, 2 não 3, 2 não 4, 2 não 5, 2 thận 6, 2 não 6, 2 não 7.) tan huyết dạng β (Hình 4.6) và 4 chủng (2 Thận 1, 2 Thận 4, 1 Thận 5, 2 Thận 5) tan huyết dạng α (Hình 4.7) và 1 chủng (2 Não 1) không tan huyết. Kết quả trên cho thấy ngoại trừ chủng vi khuẩn S. agalactiae không sử dụng máu, các chủng vi khuẩn S. iniae đều sử dụng máu (Bảng 4.1). Theo báo cáo của Yuasa et al.
(2008) trên 2 trường hợp nhiễm Streptococcus trên cá rô phi nuôi ở châu á đã khẳng định rằng S. iniae tan huyết dạng β.
Bảng 4.1 Kết quả NaCl 6,5% và tan huyết.
STT Chủng vi khuẩn Chỉ tiêu kiểm tra
NaCl 6,5 % Tan huyết
1 1 Não 2a − 2 1 Não 4 − 3 2 Não 2a − 4 2 Não 2b − 5 2 Não 3 − 6 2 Não 4 − 7 2 Não 5 − 8 2 Não 6 − 9 2 Não 7 − 10 2 Não 1 − γ 11 1 Thận 5 − 12 2 Thận 1 − 13 2 Thận 2 − 14 2 Thận 4 − 15 2 Thận 5 − 16 2 Thận 6 −
Pourgholam et al. (2009) đã phân lập và xác định một số tác nhân gây bệnh thuộc họ Streptococsi gây bệnh trên cá hồi vân (Onchorhynchus mykiss) nuôi ở Iran kết quả thu được là vi khuẩn S. iniae là vi khuẩn Gram (+) , tan huyết dạng β và không phát triển ở NaCl 6,5 %.
Hình 4.5 Các chủng vi khuẩn không phát triển trong môi trường có 6.5% NaCl Nghiên cứu của Suanyuk et al. (2010) khi kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn streptococcus iniae cũng khẳng định là tất cả các chủng đều
không phát triển ở NaCl 6,5 % và đều tan huyết ở dạng β.
Theo kết quả nghiên cứu gần đây của Erfanmanesh et al. (2011) khi
nghiên cứu về đặc điểm di truyền của S. iniae gây bệnh trên cá hồi vân (Onchorhynchus mykiss) nuôi ở Iran thì vi khuẩn S. iniae tan huyết ở 2 dạng là α hoặc β. Qua đó cho thấy kết quả thu được ở (Bảng 4.1) là tương tự với các tác giả nêu trên là vi khuẩn S. iniae gây tan huyết và không phát triển ở môi trường có bổ sung 6,5% NaCl.
4.4 Kết quả kháng sinh đồ
Sau khi đã kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa và kết quả kiểm tra bằng kít API 20 Strep xác định vi khuẩn phân lập từ cá chẽm là vi khuẩn S. agalactiae và S.
iniae. Tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ trên môi trường MHA + 1,5 % NaCl
bằng phương pháp tráng dung dịch vi khuẩn và so sánh độ đục của dung dịch vi khuẩn với ống McFarland số 3. Kết quả đo đường kính vòng vô trùng được trình bày ở Hình 4.8 và Bảng B, Phụ lục III.
Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ cho thấy 87,5 % (14/16) chủng vi khuẩn kiểm tra điều kháng với Gentamycin, Neomycin và 100 % chủng vi khuẩn nhạy với cefazolin, ciprofloxacin, doxycyclin, enrofloxacine, florfenicol, norfloxacin, tetracyclin, trimethoprim/sulfamethoxazole. Đặc biệt có 2 chủng là (1 Não 4 và 2 Não 4) nhạy trung bình với Ampicilin, Amoxcillin và nhạy với tất cả các loại kháng sinh còn lại. Kháng sinh nhạy có đường kính vòng tròn vô trùng cao nhất là Ampicilin, Amoxcillin, Cefazolin..
\
Hình 4.8 Đĩa kháng sinh đồ
Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ vi khuẩn S. iniae gây bệnh trên cá heo nước ngọt ở Amazon (Inia geoffrensis) cho thấy vi khuẩn S. iniae nhạy với
Ampicillin, Bacitracin, Carbenicillin, Cephalothin, Cephaloridine, Cloxacillin, Erythromycin, Gentamicin, Lincomycin, Methcillin, Nafcillin, Nitrofurantoin, Oleandomycin, Penicillin, Oxytetracycline. Vi khuẩn nhạy trung bình với Chloramphenicol nhưng kháng với Gantrisin, Kanamycin, Nalidixic acid, Neomycin, Polymixin B, Streptomycin, Sulfadimethoxine, Sulfisomidine (Gerald và Madin, 1976).
Nghiên cứu của Surenda (2002) cho thấy khi lập kháng sinh đồ kiểm tra vi khuẩn Streptococcus sp. Trên 20 loại kháng sinh thì kết quả thu được vi
khuẩn nhạy với Amoxycillin, Ampicillin, Carbenicillin, Cefotaxim, Cefoxitin, Cephalotin, Chloramphenicol, Clindamycin, Cloxacillin, Cotrimoxazole, Doxycycline,Erythromycin,Gentamicin,Neomycin,Oxacillin, Oxytetracycline, Penicillin G và kháng với Sulphamethoxazole, Sulphonamides, Trimethoprim.
Park et al. (2008) xác định khả năng nhạy và kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn phân lập từ các loài cá nuôi ở đảo Jeju Hàn Quốc theo kết quả cho thấy vi khuẩn Streptococcus iniae nhạy với cefotaxime, erythromycin, ofloxacin,
penicillin, tetracycline và vancomycin.
Tukmechi et al. (2009) nghiên cứu vi khuẩn Streptococsis trên cá tai
tượng da beo (Astronotus Ocellatus) đã phân lập được vi khuẩn gây bệnh S. iniae và kiểm tra kháng sinh đồ với 10 loại kháng sinh là : ampicillin, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cefazoline, enrofloxacin, lincospectin, nalidixic acid, tetracycline, erythromycin, gentamycin, streptomycinvà colistin. Kết quả kiểm tra cho thấy vi khuẩn nhạy với ampicillin, enrofloxacin và kháng với cefazoline, erythromycin, gentamycin, streptomycinvà colistin, lincospectin.
Kết quả nghiên cứu của Suanyuk et al. (2010) cho biết S. iniae nhạy cảm với 10 loại thuốc kháng sinh, bao gồm ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, gentamicin, nitrofurantoin, norfloxacine, oxytetracycline, penicillin G, sulphamethoxazol / trimethoprim và trimethoprim. Kháng với nalidixic acid và acid oxolinic.
Qua những kết quả nghiên cứu của một số tác giả nêu trên so với kết quả của đề tài cho thấy nhóm kháng sinh tetracyclines bao gồm tetracycline, doxycycline, gentamycin, neomycin…có phổ hoạt động rất rộng có thể ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao. Trong kết quả này, 100% vi khuẩn nhạy với tetracycline, doxycycline, trong khi 87,5 % vi khuẩn kháng với gentamycin và neomycin..
Nhóm kháng sinh floquinolons bao gồm: ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin… là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, có tác dụng ức chế tổng hợp ADN. Trong nghiên cứu cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn đều nhạy với nhóm quinolons. Thể hiện mức nhạy cao nhất đối với enrofloxacin với đường kính vô trùng trung bình là 26,4 mm cao hơn so với ciprofloxacin, norfloxacin.. Ở nước ta, đa số kháng sinh trong nhóm này đã bị cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Vì thế không nên sử dụng kháng sinh này trong việc điều trị bệnh do vi khuẩn S. iniae gây ra.
Nhóm beta-lactamin bao gồm các kháng sinh amoxicillin, ampicillin, cefazoline, cefalexine… là loại kháng sinh có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu có tác dụng trên vi khuẩn gram dương và một số vi khuẩn gram âm. Do màng tế bào vi khuẩn gram âm có tỉ lệ lipit cao nên nó kỵ nước, còn nhóm beta- lactamin phải khuếch tán qua các ống dẫn protein nằm trên bề mặt màng. Tuy nhiên, cũng cần lưu ý rằng tính chất của thuốc thuộc nhóm beta-lactamin là dễ bị hòa tan trong nước và thủy phân ở nhiệt độ cao nên để đạt hiệu quả khi sử dụng nhóm thuốc này cần phải khắc phục những nhược điểm như trên.
Nhóm phenicol bao gồm chloramphenicol, flophenicol...là những kháng sinh kìm khuẩn và có hiệu lực diệt khuẩn trên một vài loài, có cơ chế tác động là ức chế sự tổng hợp protein. Ở Việt Nam, thuốc kháng sinh chloramphenicol hiện đang bị nghiêm cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản do thuốc này có độc tính rất mạnh và là nguyên nhân gây ra hiện tượng thoái hóa tủy xương. Ngoài ra, chloramphenicol là loại kháng sinh có nhiều tác dụng phụ không mong như: gây suy tủy, tỉ lệ quái thai cao, gây dị ứng,…. Vì vậy tuyệt đối không được sử dụng loại kháng sinh này (Lê Nguyễn Diệu An, 2011). Bên cạnh đó flophenicol là một loại kháng sinh thế hệ mới của nhóm phenicol không những có những tính năng như chloramphenicol mà còn khắc phục được các nhược điểm gây nguy hiểm đến sức khỏe của con người .
4.5 Kết quả mô học
Thận là một trong những cơ quan nhạy cảm với tác nhân gây bệnh vì đây là cơ quan tạo máu và là cơ quan bài tiết chủ yếu của cá. Thận sau của cá có cấu tạo bởi tiểu cầu thận, các ống dẫn, ống thận, các mạch máu. Thận là cơ quan bài tiết là con đường xâm nhập chủ yếu của vi khuẩn (Trích từ Lê Thị Kim Loan, 2011). Quan sát mô bệnh học cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn xâm nhập ở mô thận của cá chẽm (Hình 4.9).
Hình 4.9 Vi khuẩn xâm nhập trong mô thận cá chẽm
Eldar và Ghittino (1999) nghiên cứu mô học trên cá hồi vân đã phát hiện vi khuẩn S. iniae có trong mô não gây hiện tượng viêm não cấp tính. Nguyễn Hữu Thịnh và ctv. (2001) trong nghiên cứu đã kiểm tra mô cá bơn và phát hiện vi khuẩn ở não và thận. Tukmechi (2009), khi quan sát mô bệnh học của cá tai tượng da beo (Astronotus Ocellatus) thấy có sự xâm nhập của vi khuẩn S. iniae trong mô tỳ tạng. Mô gan và não có hiên tượng sung huyết.
Qua đó cho thấy khi cá bị nhiễm bệnh do S. iniae gây ra thì các cơ quan thường bị tấn công là thận, tỳ tạng và não. Sự xâm nhập của vi khuẩn có thể làm biến đổi liên kết cấu trúc tế bào gan, thận, bị phá hủy, biến đổi cấu trúc và hoại tử, xuất huyết… những tổn thương ở gan, thận làm cho gan không còn chức năng khử độc, lọc máu, chuyển hóa protein, lipid, glucid, tiết mật.Quản cầu thận bị mất cấu trúc. Thận bị mất cấu trúc không thực hiệ được chức năng bài tiết các chất thải của quá trình biến dưỡng gây độc cho cơ thể. Do đó chất độc không được loại bỏ sẽ tích lũy trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác làm cá chết.
CHƯƠNG V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận
Kết quả nhuộm gram cho thấy tất cả các vi khuẩn đều là gram (+) dạng liên cầu. vi khuẩn không di động, cho phản ứng catalase âm tính, oxidase âm tính, H2S âm tính vi khuẩn không có khả năng sinh H2S, nitrate và O/F âm tính. Tất cả các chủng vi khuẩn đều không phát triển ở môi trường có bổ sung 6,5% NaCl. Có 11 chủng gây tan huyết dạng β, 4 chủng gây tan huyết dạng α và 1 chủng không gây tan huyết.
Kết quả định danh bằng bộ kit API 20 Strep xác định được chủng vi khuẩn 2 Não 1 là vi khuẩn Streptococcus agalactiae còn 15 chủng vi khuẩn
còn lại là Streptococcus iniae.
Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ cho thấy 14/16 chủng vi khuẩn kiểm tra điều kháng với Gentamycin, Neomycin, tất cả các chủng nhạy với tất cả các loại kháng sinh còn lại, kháng sinh nhạy có đường kính vô trùng cao nhất là Ampicilin, Amoxcillin, Cefazolin.
Quan sát mô thận cá chẽm thấy được sự xâm nhập của vi khuẩn S. iniae
5.2 Đề xuất
1. Xác định vi khuẩn bằng phương pháp PCR
2. Bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae với cá chẽm để xác định được độc lực vi khuẩn và những dấu hiệu khi cá bị nhiễm S. iniae.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. A. Tukmechi, R. Hobbenaghi, H. Rahmati Holasoo, and A. Morvaridi, 2009. Streptococcosis in a Pet Fish, Astronotus Ocellatus: A Case Study. World Academy of Science, Engineering and Technology 49 2009
2. Bùi Thị Huyền, 2007.Nghiên cứu thành phần ký sinh trùng ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1970) nuôi tại Khánh Hòa. Luận Văn Đại Học. Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang. 3. Bùi Thị Khuyên, 2006 . Tìm hiểu thành phần ký sinh trùng kí sinh trên cá
chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1970) tại Khánh Hòa. Luận Văn Đại Học. Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang. Luận Văn Đại Học. Trường Đại Học Vinh Nghệ An.
4. Bromage, E. S, A. Thomas, L. Owens, 1999. Streptococcus iniae, a bacterial infection in Barramundi Lates calcarifer. Dis Aqua Org, Vol. 36: 177-181.
5. Bromage, E. S., L. Owens, 2002. Infection of barramundi Lates calcarifer with Streptococcus iniae: effects of different routes of exposure. Vol. 52: