Các loài nấm men thuần khiết dùng nhiều trong sản xuất rượu vang thuộc giống
Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces oviformis.
Các chủng nấm men thuần khiết này, có sự khác nhau về tốc độ sinh trưởng, khoảng nhiệt độ thích hợp để lên men, khả năng tạo cồn và chịu cồn, khả năng chịu được pH thấp cũng như khả năng kết lắng (tạo thành dạng bông hoặc dạng bụi).
Những yêu cầu đối với nấm men rượu vang:
Có hoạt lực lên men cao đối với nước quả.
Sử dụng đường cho lên men gần như hoàn toàn.
Kết lắng tốt.
Làm trong dịch rượu nhanh.
Chịu được độ rượu cao và độ acid của môi trường cũng như các chất sát trùng.
3.6 Các yếu tố ảnh hư ng đến lên men rượu vang 3.6.1 Oxy
Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang thuộc giống
Saccharomyces. Chúng là nhóm vi sinh vật kị khí tùy tiện. Khi trong môi trường đủ
lượng oxy nấm men phân hủy đường dùng làm nguồn năng lượng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối.
Trường hợp thiếu oxy (kị khí) nấm men sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường để sinh trưởng và chủ yếu là lên men.
Trong quá trình lên men giai đoạn đầu yêu cầu oxy cao nhất để nấm men sinh sản, phát triển tăng sinh khối. Nếu có giai đoạn nhân giống thì cũng cần phải cung cấp oxy bằng cách lắc hoặc sục khí.
3.6.2 Nhiệt độ
Nhiệt độ lên men có ảnh hưởng đến đời sống của nấm men, đến quá trình lên men và chất lượng của sản phẩm.
Nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất rượu vang đã xác định được khoảng nhiệt độ lên men rượu vang trắng thích hợp là 15 – 300C, nếu lên men ở những thang độ thấp hơn thì càng tốt. Còn lên men rượu vang đỏ (nước quả lẫn với xác quả) phải chiết xuất các chất thơm và polyphenol từ vỏ quả nên cần thang độ cao hơn, thường là 250C.
Nhiệt độ lên men cao, thời gian của quá trình lên men ngắn, độ cồn có thể thấp, đường sót còn nhiều và hương vị của sản phẩm có khi không tốt.
3.6.3 Hàm lượng đường
Trong nước quả thường có hàm lượng đường không đều do vậy người ta thường bổ sung thêm đường saccharose. Đa số các loại nấm men hoạt động bình thường trong môi trường đường dưới 20%. Có một số chủng hoạt động ở môi trường có đường cao hơn. Khi nhân giống thường dùng môi trường có đường thấp dưới 10%.
3.6.4 pH của môi trường
Trong thực tế lên men những dịch quả chua thường được rượu vang ngon. Đối với dịch quả thường có độ pH từ 2,8 – 3,8. Khoảng pH này nấm men vẫn hoạt động được. Vùng pH tối thích của nấm men là 4 – 6.
Trong sản xuất rượu vang người ta thường chuẩn bị môi trường nước quả có độ pH bằng 3,0 – 3,5.
3.6.5 Nguồn chất khoáng
Các chất khoáng chính (tính theo phần trăm khối lượng tro) bao gồm: K2O (23 – 48%), Na2O (0,06 – 2,2%), CaO (1,0 – 4,5%), MgO (3,7 – 8,5%), Fe2O3 (0,06 – 7,3%), P2O5 (45 – 59%), SO3 (0,4 – 6,3%), SiO2 (0 – 1,8%), Cl (0,03 – 1,0%).
Lượng nhỏ các chất Al, Br, Cr, Cu, Pb, Mn, Ag, Sr, Te, Sn, Zn,…tất cả các muối khoáng chiếm 5 - 10% khối lượng khô của men.
Đa số trong nước quả có các hợp chất nitơ đủ cung cấp cho nấm men. Tuy nhiên cũng có trường hợp không đủ nguồn nitơ do đó cần bổ sung thêm nguồn nitơ.
3.6.6 Chất kích thích men
Cũng như các sinh vật cao cấp, men cần một số chất kích thích, trước hết là vitamin để sinh sản và hoạt động. Một số loài men có thể tổng hợp được những vitamin nhất định, lấy nguyên liệu từ các chất hữu cơ trong nước quả. Những vitamin khác, men không tự tổng hợp được, nếu không có sẵn trong nước quả thì men ngừng hoạt động. Vitamin trong vang nhiều hơn trong nước quả như riboflavin (B2), Cabalamin, Axit p-aminobenzoic vì men tiêu thụ ít trả lại nhiều. Có vitamin trong vang ít hơn vì men tiêu thụ nhiều trả lại ít (Thiamine tức B1, Biotin tức H). Có vitamin trong vang và trong nước quả hàm lượng ngang nhau do tiêu thụ và trả lại bằng nhau (axit pantothenic).
Ngoài hoạt động của men và khuẩn, vitamin còn bị nhiều yếu tố khác ảnh hưởng: ánh sáng, lọc, xử lý nhiệt,... Một số chuyên gia Pháp đề nghị cho thêm vào những nước quả nghèo đạm, nghèo vitamin hỗn hợp sau đây: (NH4)2SO4: 100 g, thiamin tức vitamin B1: 0,250 g, Canxi pantothenat: 0,250 g, biotin tức vitamin H: 0,002 g. Trong 1 lít nước quả thêm 0,2 g hỗn hợp này.
3.7 Cơ chế và các yếu tố ảnh hư ng đến uá tr nh lên men rượu 3.7.1 Cơ chế lên men rượu
Rượu được tạo ra chủ yếu nhờ các tế bào nấm men phân giải glucose thông qua con đường EM (Embden-Meyerhoff). Quá trình lên men rượu là một quá trình phức tạp. Đầu tiên, đường thẩm thấu vào tế bào nấm men. Ở đó, đường được chuyển hóa qua hàng loạt sản phẩm trung gian và tạo thành acid pyruvic. Acid pyruvic dưới tác
dụng của enzym Pyruvat-decacboxylase sẽ bi mất CO2 và tạo thành Acetaldehit. Enzym này có coenzym là Thiaminpyrophosphat và cần có ion Mg++ làm chất hoạt hóa. Sau đó, acetaldehit bị khử thành cồn etylic và CO2 do enzym Acoldehdrogenase xúc tác.
Phương trình tóm tắt quá trình lên men rượu
C6H12O6 Lên men 2C2H5OH + 2CO2 + 113,4 KJ
3.7.2 Những yếu tố ảnh hư ng đến uá tr nh lên men rượu 3.7.2.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt động trao đổi chất của nấm men. Thông thường nấm men hoạt động tốt nhất ở 20-300C, dưới 160C lên men rất chậm, trên 350C các hệ enzym trong cơ thể nấm men bị giảm hoạt lực đến mức tối thiểu, hoạt động trao đổi chất bị ngưng trệ. Nếu nhiệt độ trên 400C nấm men do không tổng hợp được năng lượng dự trữ cần thiết nên sẽ chết.
Trong giới hạn nấm men hoạt động được, nhiệt độ lên men càng thấp, thời gian lên men càng dài, hiệu suất chuyển hóa đường thành rượu sẽ cao, chất lượng rượu vang khi đó tốt hơn, hương thơm tạo thành sẽ khuếch tán vào trong dịch.
3.7.2.2 Độ pH
Độ pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng của nấm men. Những pH thích hợp cho sự phát triển và lên men rượu của nấm men không cố định, pH càng phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, chủng, nấm men, thành phần của môi trường lên men, điều kiện lên men (nhiệt độ, thời gian).
Nhìn chung, nấm men có thể phát triển trong môi trường có pH = 2 - 8, nhưng thích hợp nhất là từ 4 - 4,5. Mặt khác, vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn. Vì vậy trong lên men rượu để ngăn ngừa hiện tượng nhiễm khuẩn, người ta thực hiện trong giới hạn pH = 3,8 - 4,0.
3.7.2.3 Nồng độ đường trong dung dịch lên men
Đường là cơ chất của quá trình lên men nên ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất lên men, nấm men có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng phù hợp từ 22 - 250 Brix. Trong giới hạn này, nếu nồng độ đường cao, rượu càng mạnh do hàm lượng etylic cao, nên thêm đường vào dịch lên men là biện pháp phổ biến nâng cao độ cồn.
Nhà bác học Bendensvin (năm 1959) đã nghiên cứu bằng thực nghiệm này và rút ra kết luận: “Từ lượng đường tối đa 30%, khả năng lên men bắt đầu giảm. Những nấm men chịu được nồng độ cao là những nấm men chịu được áp suất thẩm thấu đường mạnh”.
Khi gia tăng nồng độ đường trong môi trường sẽ kéo dài thời gian lên men và hiệu suất rượu từ một đơn vị đường giảm, lượng rượu tạo ra không đáng kể. Nguyên nhân là phần lớn các tế bào nấm men bị chết do hiện tượng co nguyên sinh.
Ngoài ra, sự lên men trong môi trường có nồng độ đường cao, dẫn đến hiện tượng acid bay hơi sinh ra nhiều. Để tránh điều này cũng như để gia tăng hiệu suất rượu, cần cho đường vào từ từ.
3.7.2.4 Nồng độ rượu etylic
Rượu etylic là sản phẩm chính của quá trình chuyển hóa đường. nồng độ rượu khi đạt đến 5% thể tích đã ức chế khả năng sinh sản của nấm men. Khi độ rượu đạt 7 - 8% thể tích, sự trao đổi chất trong nấm men bị ngừng trệ hầu như toàn phần, quá trình lên men chuyển sang thời kỳ lên men thầm lặng.
Ảnh hưởng của nồng độ rượu etylic đối với các loại nấm men khác nhau thì khác nhau. Ảnh hưởng này phụ thuộc nhiều yếu tố: loại nấm men, độ pH, nhiệt độ môi trường lên men.
3.7.2.5 Thời gian lên men
Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ lên men, nồng độ đường dịch lên men, chủng loại nấm men.
Quá trình lên men bao gồm lên men chính và lên men phụ, thời gian lên men tính từ lúc cấy men giống vào môi trường lên men. Sự lên men thật sự kết thúc khi nấm men hết khả năng chuyển hóa đường thành rượu và CO2. Càng về cuối giai đoạn lên men, bọt khí sinh ra ít hơn và nhỏ dần đi, tốc độ lưu chuyển của chúng cũng giảm theo.
Kết thúc lên men chính, nồng độ đường giảm đáng kể, bọt khí giảm rất chậm và ít. Thực tế, biểu hiện kết thúc lên men phụ khó nhận ra vì khí CO2 lúc này không còn khả năng tạo bọt nổi lên trên mà khuếch tán ngay vào rượu. Chính vì vậy thời gian tàng trữ rượu từ 3 tháng trở lên mới cho rượu có giá trị cảm quan cao.
Ở nhiệt độ trung bình từ 25 - 300
C nếu pH khác nhau thì thời gian lên men khác nhau, nhiệt độ này thích hợp cho nấm men phát triển, thời gian lên men kéo dài từ 15 - 20 ngày. Ở nhiệt độ cao 50 - 600C, quá trình lên men bị dừng, tế bào nấm men chết dần.
3.7.2.6 Nấm men trong sản xuất rượu vang
Hầu hết nấm men thuộc giống Saccharomyces sp để lên men. Ngày nay, mỗi cơ sở sản xuất rượu nho có riêng bộ giống nấm men của mình qua quá trình tuyển chọn lâu dài.
3.8 Các yếu tố lý – hóa ảnh hư ng đến hoạt động của nấm men 3.8.1 Ảnh hư ng của oxy
Nấm men vang được coi là vi sinh vật sống hiếu khí tùy tiện. Trong điều kiện có nhiều oxy thì hoạt động sinh sản của nấm men mạnh mẽ hơn, vì vậy lượng sinh khối tăng lên nhanh và trở thành sản phẩm chủ yếu trong môi trường lên men. Ngược lại, trong điều kiện thiếu hoặc không có mặt O2, nấm men sẽ chuyển từ hoạt động hô hấp sang lên men kỵ khí, khi đó sản phẩm trong môi trường là etanol sẽ trở thành chủ yếu. Tuy nhiên, hai kiểu hô hấp trên đều có mối quan hệ chung với nguồn đường có trong môi trường. Qua thực tế sản xuất rượu vang cho thấy: lượng đường tiêu hao cho hô hấp hiếu khí chiếm khoảng 1/5, tiêu hao cho hô hấp kỵ khí là 4/5 (thực chất là lên men để tạo etanol).
3.8.2 Ảnh hư ng của nhiệt độ
Nấm men khá bền vững trong nhiệt độ thấp: nó có thể sống trong băng nhiều tháng, thậm chí ở nhiệt độ – 190oC. Nấm men rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, trong môi trường lỏng ở nhiệt độ 40 – 50oC nấm men hầu như ngưng trệ hoạt động và sau 90 phút sẽ bị chết; ở nhiệt độ 60 – 65oC chúng sẽ bị chết sau 5 phút. Trong môi trường khô (với W = 13%) chúng chịu nhiệt tốt hơn, có thể chịu đến 85 – 105oC. Nấm men tạo bào tử cũng tương tự, tuy có khá hơn nấm men không tạo bào tử, ví dụ trong môi trường canh khô chúng có thể chịu được đến 115 – 125oC.
Nhiệt độ tối ưu cho nấm men vang là 25 – 28oC. Ở 160C, nấm men hoạt động chậm và yếu hơn. Nhiệt độ có thể tăng đến 36oC mà nấm men vang vẫn hoạt động bình thường, song trên 36oC thì nấm men bắt đầu bị ức chế, đến 38oC thì gần như không hoạt động và đến 40oC thì chúng lại bắt đầu chết dần. Ở điều kiện to >= 40oC thì
lại rất thuận lợi cho vi khuẩn sinh acid acetic hoạt động, do đó trong sản xuất rượu vang cần phải kiểm soát không để nhiệt độ lên men vượt quá 36oC.
3.8.3 Ảnh hư ng của ánh sáng
Ánh sáng là yếu tố kìm hãm hoạt động của nấm men vang. Đặc biệt các tia cực tím trong ánh sáng sẽ giết chết tế bào nấm men, vì vậy quá trình lên men phụ thuộc của từng mùa.
3.8.4 Ảnh hư ng của các acid hữu cơ
Nấm men vang có thể bảo vệ được hoạt tính (sống) ở 10 – 20 g/l acid tự do (acid tactric, acid malic, acid citric). Chúng có thể hoạt động tốt trong môi trường có 8 – 10 g/l acid (với môi trường này thì hầu như các loài vi khuẩn đều bị ức chế). Hoạt động của vi khuẩn acetic có ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men vang, ở pH < 2,6 thì chúng không hoạt động được, ở pH từ 3,5 – 4,5 là tối ưu cho vi khuẩn acetic, trong khi đó pH tối ưu cho những vi khuẩn khác là 7. Vì vậy môi trường dịch quả càng chua (pH càng thấp) thì càng hạn chế được hoạt động của nhiều loại vi khuẩn.
3.8.5 Ảnh hư ng của ethanol
Sản phẩm chủ yếu của lên men kỵ khí là etanol. Etanol kìm hãm (ức chế) hoạt động sống của tế bào nấm men, tuy nhiên mức độ kìm hãm khác nhau đối với các chủng, nòi nấm men khác nhau. Ví dụ, đối với S. ellipsoideus có thể chịu đựng được 18% V etanol, nhưng với KL. Apiculata chỉ chịu đựng được từ 4 – 6% etanol. Khả năng chịu đựng etanol của nấm mốc, vi khuẩn còn kém hơn nhiều so với nấm men. Điều này thực sự có ý nghĩa lớn trong sản xuất, bởi vì khi quá trình lên men kỵ khí bắt đầu xảy ra thì những sản phẩm etanol hình thành trong môi trường có tác dụng kìm hãm (ức chế) mạnh mẽ nấm mốc, vi khuẩn (luôn có đi kèm trong dịch nho), và sau đó là ức chế những nấm men dại đi lẫn với S. ellipsoideus, để rồi phải nhường môi trường cho nấm men vang hoạt động.
3.8.6 Ảnh hư ng của CO2
Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh sự sinh sản của nấm men vang. Theo nghiên cứu của Miuler – Thurau, khi:
Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt đến 0,25% trọng lượng thì việc sinh sản của nấm men bị đình trệ.
Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt đến 1,5% trọng lượng CO2 thì nấm men không còn sinh sản được nữa.
Với hàm lượng CO2 như trên, ở nhiệt độ 15oC sẽ có áp suất 7,7 atm, nấm men vẫn sống và tiếp tục lên men kỵ khí.
3.8.7 Ảnh hư ng của pH
Độ pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng của nấm men. Nhìn chung, nấm men có thể phát triển trong môi trường có pH = 2 - 8, nhưng thích hợp nhất là từ 4 - 4,5. Mặt khác, vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn. Vì vậy trong lên men rượu để ngăn ngừa hiện tượng nhiễm khuẩn, người ta thực hiện trong giới hạn pH = 3,8 - 4,0.
3.8.8 Ảnh hư ng của nồng độ đường trong dung dịch lên men
Đường là cơ chất của quá trình lên men nên ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất lên men, nấm men có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng phù hợp từ 22 - 250 Brix. Trong giới hạn này, nếu nồng độ đường cao, rượu càng mạnh do hàm lượng etylic cao, nên thêm đường vào dịch lên men là biện pháp phổ biến nâng cao độ cồn.
Nhà bác học Bendensvin (năm 1959) đã nghiên cứu bằng thực nghiệm này và rút ra kết luận: “Từ lượng đường tối đa 30%, khả năng lên men bắt đầu giảm. Những nấm men chịu được nồng độ cao là những nấm men chịu được áp suất thẩm thấu đường mạnh”.
Khi gia tăng nồng độ đường trong môi trường sẽ kéo dài thời gian lên men và hiệu suất rượu từ một đơn vị đường giảm, lượng rượu tạo ra không đáng kể. Nguyên nhân là phần lớn các tế bào nấm men bị chết do hiện tượng co nguyên sinh.
Ngoài ra, sự lên men trong môi trường có nồng độ đường cao, dẫn đến hiện tượng acid bay hơi sinh ra nhiều. Để tránh điều này cũng như để gia tăng hiệu suất rượu, cần cho đường vào từ từ.