Nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật nested PCR nhằm tăng ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phương pháp PCR ựể xác ựịnh sự có mặt của PCV2.
- Outer PCR (PCR vòng ngoài) ựược thực hiện bởi cặp mồi CV1 (mồi xuôi, forward) và CV2 (mồi ngược, reverse), cho sản phẩm 987bp. Sản phẩm này sẽ ựược sử dụng trong giải trình tự gen.
- Vị trắ bắt mồi ựược thiết kế bắt cặp với vùng ổn ựịnh (conserved regions) ở ựầu ORF1 và ORF2.
- Sản phẩm outer PCR sẽ ựược dùng như sợi khuôn trong phản ứng nested PCR. Inner PCR ựược thực hiện với cặp mồi VF2 (mồi xuôi) và VR2 (mồi ngược) tổng hợp sản phẩm 359bp.
Thiết kế nested PCR có thể tận dụng ựược sản phẩm outer PCR cho giải trình tự.
Sơ ựồ vị trắ mồi và sản phẩm nested PCR ựược minh họa ở hình 2.1
Hình 2.1. Sơ ựồ vị trắ mồi phản ứng nested PCR
Hóa chất dùng tách chiết ADN tổng số gồm: (1) dung dịch ly giải mẫu có chứa 27% sucrose, 15 mM trisodium citrate, 0,15 M NaCl, 1 mM ethylene diaminetetraacetic acid, 1% sodium dodecyl sulphate, 200 ộg/ml proteinase
K; (2) phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1); (3) isopropyl; (4) cồn 70%; (5) dung dịch ựệm TE (pH=8).
Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản ứng nested PCR: (1) hot start PCR kit (i-StarMaster, iNtRON Biotechnology, Korea); (2) cặp mồi ựặc hiệu dùng cho phát hiện và ựịnh type PCV2 do hãng BioNERR sản xuất ựược lựa chọn dựa theo các nghiên cứu ựã công bố trước ựây (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi của phản ứng nested PCR ựể xác ựịnh genotype
và giải trình tự PCV2 Primer Trình tự mồi (5Ỗ - 3Ỗ) Kắch thước sản phẩm (bp) Vị trắ nucleotide Tài liệu tham khảo CV1-forward AGG GCT GTG GCC TTT GTT AC 1329-1348
CV2-reverse TCT TCC AAT CAC GCT TCT GC
987
530-549
CV3-forward TGG TGA CCG TTG CAG AGC AG 452-471
CV4-reverse TGG GCG GTG GAC ATG ATG AG
1092
1525-1544
Fenaux và cs,
2000
PCV2 Ờ VF2 GAA GAA TGG AAG AAG CGG 62-79
PCV2- VR2 CTC ACA GCA GTA GAC AGG T
359
403-421
Yang và cs, 2003 PCV2a Inner-F GGG TAT AGA GAT TTT GTT GGT C 1460-1481
PCV2a Inner-R GCA CCT TCG GAT ATA CTG TC
125
1584-1603 PCV2b Inner-F CAC AGA GCG GGG GTT TGA GC 1462-1481 PCV2b Inner-R CCG TTA CCG CTG GAG AAG GA
172
1633-1652
Kim và cs, 2010
Ghi chú: cặp mồi ựể chẩn ựoán (CV1/CV2; VF2/VR2); cặp mồi ựể ựịnh type (2aF/2aR và 2bF/2bR); cặp mồi ựể giải trình tự (CV1/CV2; CV3/CV4)
Mẫu: nếu là huyết thanh có thể trộn tối ựa là 4 mẫu huyết thanh; nếu là bệnh phẩm tiến hành kiểm tra riêng với từng mẫu ựã ựược ựồng nhất.
2.5.3.1. Phương pháp tách ADN
Các bước chiết tách ADN tổng số từ mẫu huyết thanh/huyễn dịch bệnh phẩm 10% gồm:
(1) Ly giải mẫu (250 ộl) trong dung dịch sucrose/proteinase K (500 ộl) ở 56oC/90 phút hoặc 370C/12giờ,
(2) Tách pha ADN bằng dung dịch phenol:chloroform:isoamyl (25:24:1) (200 ộl). Vortex hỗn hợp (có màu trắng sữa là ựược).
Ly tâm 12000 vòng/15 phút, ở nhiệt ựộ 40C
(3) Tủa ADN bằng isopropyl ở -20oC/15 phút: dùng ống eppendorf mới, trộn 450ộl isopropyl + 450ộl dịch nổi phắa trên mẫu. Trộn ựều.
(4) Tinh sạch ADN bằng cồn 70%,
- Rửa mẫu bằng cồn 70%: 1ml. Ly tâm, 12.000 vòng/15 phút, ở nhiệt ựộ 40C. Loại bỏ hết cồn. để khô ở nhiệt ựộ phòng 15 phút.
(5) Cặn ADN ựược hòa tan trong 30 ộl dung dịch ựệm TE, ựể 5 phút, tiến hành trộn ựều.
Pha hỗn hợp trong 1 eppendorf mới: 17 ộl i star Master mix solution + 1 ộl mồi xuôi + 1 ộl mồi ngược + 1 ộl mẫu ựã cho TE buffer.
Trộn ựều, tiến hành chạy PCR.
2.5.3.2.Phương pháp nested PCR chẩn ựoán và ựịnh genotype PCV2
Các bước thực hiện gồm: (1) tổng hợp sản phẩm PCR vòng ngoài sử dụng cặp mồi ựặc hiệu CV1/CV2 chung cho các genotype; (2) xác ựịnh sự có mặt của PCV2 với cặp mồi VF2/VR2 chung cho tất cả genotype; (3) ựịnh type bằng cặp mồi ựặc hiệu genotype 2aF/2aR (PCV2a) và 2bF/2bR (PCV2b). Thành phần phản ứng PCR ựược phối trộn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Chu trình nhiệt của phản ứng ựược trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR chẩn ựoán và ựịnh type PCV2
Cặp mồi Các giai ựoạn
của phản ứng Nhiệt ựộ (0C) Thời gian (giây) Số vòng lặp Tiền biến tắnh 94 300 1 Biến tắnh 94 20 Bắt mồi 61 20 Kéo dài 72 90 35 CV1/CV2; CV3/CV4
Kéo dài cuối cùng 72 300 1
Tiền biến tắnh 94 300 1 Biến tắnh 94 20 Bắt mồi 55 20 Kéo dài 72 30 35 VF2/VR2
Kéo dài cuối cùng 72 300 1
Tiền biến tắnh 94 300 1 Biến tắnh 94 20 Bắt mồi 57 20 Kéo dài 72 20 35 2aF/2aR 2bF/2bR
Kéo dài cuối cùng 72 300 1
Sản phẩm PCR ựược phân tắch bằng phương pháp ựiện di trong thạch agarose 1,5% có bổ sung 0,5 ộg/ml ethidium bromide.