Dòng nấm men BT21 được gửi đến Công ty Macrogen Hàn Quốc để giải trình tự giữa ITS1, ITS2 và 5,8S ribosomal DNA. Kết quả giải trình tự được so sánh tương đồng với dữ liệu trên ngân hàng gene NCBI để xác định đến mức độ loài của dòng nấm men.
Kết quả cho thấy trình tự thu được tương đồng với vùng ITS1, ITS4 và 18S
ribosomal DNA gene của loài Saccharomyces cerevisiae, mã số (Accesion number)
KC515364, mức độ tương đồng 99%. Do đó dòng BT21 được xác định là loài
Saccharomyces cerevisiae.
Hình 31. Kết quả định danh dòng nấm men BT21
Kết quả nghiên cứu của Markov et al., (2001) cũng cho thấy Saccharomyces
cerevisiae là một trong 05 chủng nấm men thường được phân lập trong thủy sâm (Saccharomycodes ludwigii, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bisporus, Torulopsis sp. và Zygosaccharomyces sp.).
CHƢƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Kết quả đã phân lập và tách ròng được 23 dòng nấm men từ 5 địa phương thuộc 3 tỉnh khác nhau: Cần Thơ (Cờ Đỏ, Trà Nóc và An Thới); Bến Tre và Hậu Giang.
Sau 05 ngày lên men, lượng ethanol trung bình thu được của dòng nấm men BT21 (5,5 %v/v) cao hơn 22 dòng nấm men còn lại. Bên cạnh đó dòng nấm men BT21 có thời gian lên men sớm nhất (sinh khí làm đầy ống Durham sau 8 giờ). Như vậy, dòng nấm men BT21 có hoạt tính lên men ethanol tốt nhất và được sử dụng cho các thí nghiệm.
Sau 07 ngày lên men cho thấy ở mật số nấm men – vi khuẩn bằng 5 – 5 (Log tế bào/mL) lượng ethanol (6,6 %v/v) và acid trung bình thu được cao nhất (0,20 %w/v).
Ở nồng độ đường bằng 15oBrix và pH=5,5 ban đầu, lượng ethanol (6,9 %v/v) và
acid (0,21 %w/v) thu được cao nhất (sau 07 ngày lên men).
Trong 09 ngày lên men ở 30oC lượng ethnol (7,7 %v/v) lượng acid trung bình (0,25%w/v) thu được cao nhất.
Lượng ethanol (x) và acid acetic (y) sinh ra có mối tương quan khá chặt chẽ và được biểu diễn bời phương trình tuyến tính đơn có dạng: y = 0.119 + 0.0169x với hệ
số xác định R2 = 80,3 % (độ tin cậy 95%).
Kết quả định danh xác định dòng nấm men BT21 là loài Saccharomyces
cerevisiae.
5.2. Đề nghị
Khảo sát đa dạng và chi tiết hơn các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men và vi khuẩn acid acetic như: Nguồn carbon, loại trà, nồng độ trà,...
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Mai Tuyên, Vũ Bích Lan, Ngô Đại Quang. (2008). Nghiên cứu chiết xuất và xác định
tác dụng kháng oxy hoá của polyphenol từ lá chè xanh việt nam.
Nguyễn Công Hà. 2000. Bài giảng kỹ thuật lên men rượu bia, Trường Đại Học Cần
Thơ.
Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng . 2005. Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic. NXB Khoa học Kỹ thuật.
Nguyễn Lân Dũng, 1999. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo dục.
Nguyễn Văn Thành. 2008. Giáo trình thực tập Công nghệ lên men thực phẩm. Trường
Đại học Cần Thơ.
Trịnh Xuân Ngọ. 2007. Cây chè và kỹ thuật chế biến. NXB Khoa học tự nhiên và
Công nghệ.
Tiếng Anh
Aidoo, K. E., Nout, M. J. R., and Sarkar, P. K. (2006). Occurrence and function of
yeasts in Asian indigenous fermented foods. FEMS Yeast Research, 6(1), 30-39.
Bauer-Petrovska, B., and Petrushevska-Tozi, L. (2000). Mineral and water soluble
vitamin content in the Kombucha drink. International Journal of Food Science
and Technology, 35(2), 201-205.
Blanc, P. J. (1996). Characterization of the tea fungus metabolites. Biotechnology
Letters, 18(2), 139-142.
Chi Tang Ho. (2008). Tea and Tea Products, Chemistry and Health-Promoting
Properties.
Dufresne, C., and Farnworth, E. (2000). Tea, Kombucha, and health: a review. Food
Research International, 33(6), 409-421.
Ernst, E. (2003). Kombucha: a systematic review of the clinical evidence. Forschende
Komplementarmedizin und Klassische Naturheilkunde.[Research in Complementary and Natural Classical Medicine], 10(2), 85-87.
Jacobson, G.K. and S.O. Jolly. 1989. Yeasts, molds and algae. Biotechnology, 7: 279-
314.
Jacobson, G.K. and Jolly, S.O. 1989. Yeasts, molds and algae. Biotechnology 7: pp. 279-314.
Hacking, A.J., I.W.F Taylor and C.M. Hanas. 1984. Selection of yeast able to produce
ethanol from glucose at 40ºC. Applied Microbiology and Biotechnology, 19: 361.
Helena da Cruz, S., M. Batistote and J.R.Ernandes. 2003. Effect of sugar catabolite repression in correlation with the structural complexity of nitrogen source on
yeast growth and fermentation. Journal of Industrial and Brewing, 109(4): 349-
355.Kurtzman, C.P. and J.W. Fell. 1997. The Yeasts, a Taxonomic Study. Fourth
Edition.
Kurtzman, C.P. and Fell, J.W. 1997. The Yeasts, a Taxonomic Study. Fourth Edition. Amsterdam: Elsevier Science Publishing Company.
Kurtzman, C.P. and J. Piškur. 2006. Taxonomy and phylogenetic diversity among the
yeasts. Topics in Current Genetics, 15: 29-46.
Markov, S. L., Malbaša, R. V., Hauk, M. J., & Cvetkovic´ , D. D. (2001). Investigation of tea fungus associations. I. The yeasts. Acta Periodica Technologica, 32, 133– 138.
Norr, A.A., A. Hameed, K.P. Bhatti, and S.A. Tunio. 2003. Bio-ethanol fermentation
by the bioconversion of sugar from dates by Saccharomyces cerevisiae strain
ASN-3 and HA-4. Biotechnology, 2(1): 8-17.
Selma E. Ahmed and Hamid A. Dirar. 2005. Studies on the Microbiology of Kombucha (Tea Fungus). U. of K. J. Agric. Sci. 13 (1), 69-84
Sreeramulu, G., Zhu, Y., and Knol, W. (2000). Kombucha fermentation and its
antimicrobial activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(6), 2589-
2594.
Liu, C.-H., Hsu, W.-H., Lee, F.-L., & Liao, C.-C. (1996). The isola-tion and
identication of microbes from a fermented tea beverage, Haipao, and their interactions during Haipao fermentation. Food Microbiology, 13, 407±415.
Trang web
http://yume.vn, 1/10/2013
http://namthuysam.com/ ngày 17/9/2012
_____________________________________________________________________________________________________
Kính hiển vi PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Hình ảnh các thiết bị sử dụng trong môi trƣờng xung quanh thí nghiệm
Cân phân tích Hệ thống chƣng cất rƣợu
Khúc xạ kế
pH kế Tủ cấy
_____________________________________________________________________________________________________
Phụ lục 2. Các phƣơng pháp phân tích
2.1. Phƣơng pháp nhân giống, đếm mật số nấm men (Nguyễn Xuân Thành, 2005) Môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng PGA lỏng.
- Lấy mẫu:
+ Lấy mẫu có tính chất đại diện.
+ Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích. + Dụng cụ lấy mẫu phải vô trùng.
- Nhân giống nấm men: cho môi trường PGA lỏng vào bình tam giác đậy kín bằng
nút gòn, nắp giấy, đem khử trùng nhiệt ướt ở 121°C trong 15 phút, để nguội, chủng nấm men vào, đặt lên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi nhân giống, kiểm tra mật số nấm men bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
- Đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu.
+ Lắc đều ống nghiệm chứa mẫu đã pha loãng, dùng ống hút hút một giọt vào mặt kính, đậy lá kính lên lưới đếm. Chú ý không để tạo thành bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh.
+ Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi, sau đó tiến hành đếm tế bào trong 4 ô lớn ở 4 góc. Trong mỗi ô lớn, đếm lần lượt từ ô con thứ nhất đến ô con thứ 16. Chỉ đếm tế bào nằm bên trong ô con và những tế bào nằm 2 cạnh liên tiếp cùng chiều. Ghi số lượng tế bào đếm được trong 4 ô lớn. Đếm cả 2 buồng đếm sau đó lấy giá trị trung bình. Sau khi dùng xong buồng đếm và lá kính phài được đem đi rửa ngay và lau khô.
+ Số lượng tế bào trong 1mL mẫu dịch được tính bằng công thức:
Số tế bào/mL = (a*4000*103*c)/b
Trong đó : a: số tế bào trong 4 ô lớn.
b: số ô con trong 4 ô lớn.
103: chuyển mm3 bằng mL (1000mm3 = 1mL).
c: độ pha loãng (100 lần).
2.2. Phƣơng pháp điều chỉnh độ Brix
Để có được độ Brix mong muốn, áp dụng công thức xác định độ khô cần cho dịch lên men để bổ sung thêm đường (Nhóm Giảng viên bộ môn CNTP, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ, 2003).
b/100 = (a+x)/(100+x)
Tổng lượng đường bổ sung: c = md * x * 10
Trong đó:
a: độ Brix dịch sau khi lọc. b: độ Brix cần đạt được.
x: khối lượng đường cần bổ sung cho 100g dịch.
md: khối lượng dịch ban đầu.
Sau khi thêm đường, dùng đũa thủy tinh khuấy từ từ cho đường tan hoàn toàn, kiểm tra lại độ Brix bằng Brix kế cầm tay.
2.3. Đo pH
Giá trị pH được đo trực tiếp bằng pH kế.
2.4. Hàm lƣợng chất hòa tan (độ Brix)
Đo bằng Brix kế cầm tay.
2.5. Xác định độ rƣợu bằng phƣơng pháp chƣng cất
Cho 100mL dung dịch sau khi lên men vào bình cầu của hệ thống chưng cất cồn, tiến hành chưng cất và thu lấy 100mL, chú ý đừng để cho rượu bay hơi.
_____________________________________________________________________________________________________
Sau khi để dịch cất ổn định nhiệt độ, cho dịch cất vào ống đông có đường kính gấp 2 lần đường kính nơi to nhất của rượu kế. Thả rượu kế vào đọc độ rượu (dùng rượu kế 0-
30o) và nhiệt độ, sau đó quy về nồng độ rượu ở nhiệt độ chuẩn 20°C.
2.6. Hàm lƣợng acid tổng số quy về acid citric trong mẫu (Phạm Văn Sổ và Bùi Thị Nhƣ Thuận, 1991)
Lấy 100mL nước cất (đã tách khí bằng cách đun sôi, làm nguội) cho vào bình tam giác 250mL, cho vào 1mL dung dịch chỉ thị phenolphtalein. Đặt bình tam giác lên máy khuấy từ và khuấy đều.
Nhẹ nhàng đặt đầu cực đo của máy pH vào dung dịch (tránh va chạm với cánh khuấy từ) và dùng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn tới pH=8,2 (có xuất hiện màu hồng nhạt bên trong khoảng 1 phút). Lượng NaOH 0,1N tiêu hao này không cần tính.
Cho chính xác 5mL dịch trà sau khi lên men và tiếp tục chuẩn bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi đạt pH=8,2 (có màu hồng nhạt bên trong khoảng 1 phút). Như vậy số mL NaOH 0,1N cần để trung hòa là n mL.
Hàm lượng acid tổng số trong dịch mẫu thử được tính theo mg đương lượng trên 1 lít dịch quả (mEq/L) hoặc gram acid/1 lít (g/L). Ở đây hàm lượng acid tổng được tính theo acid citric.
Ax = (n * 0.0064*1000)/V , g/L
Trong đó:
Ax – lượng acid có trong 1 lít sản phẩm, g/L;
n – số mL NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân mẫu thực, mL;
V – lượng mẫu mang đi phân tích (V=5mL);
0.64 – số gram acid citric tương ứng với 1mL NaOH 0,1N
2.7. Hàm lƣợng ester trong mẫu (Phạm Văn Sổ và Bùi Thị Nhƣ Thuận, 1991)
Lấy chính xác 10mL mẫu dịch trà lên men (độ cồn thấp) cho vào bình tam giác, thêm 5 giọt chỉ thị phenolphtalein, lắc đều. Dùng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn tới màu hồng nhạt bền trong 30 giây. Thêm chính xác 10mL NaOH 0,1N, lắc đều. Lắp ống làm lạnh và đun bằng đèn cồn trong 1 giờ. Sau khi bình nguội, tháo ống làm lạnh. Chuẩn bằng dung dịch
Hàm lượng este (X2) tính bằng số mg etyl axetat có trong 1 lít rượu 1000 theo công thức: 0 2 2 1 1 2 1000 100 8 , 8 ) ( AV x x x N V N V X Trong đó: V0: thế tích rượu phân tích (mL). V1: thể tích NaOH đã dùng (mL) V2: thể tích H2SO4 đã dùng (mL). N1: nồng độ NaOH N2: nồng độ H2SO4
8,8: số mg etyl axetat tương ứng với 1 mL dung dịch NaOH 0,1N.
1000: hệ số chuẩn ra lít
A: độ rượu ở 20ºC
2.8. Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí
Cấy một thể tích xác định mẫu đã pha loãng vào môi trường thạch dinh dưỡng trong
đĩa petri bằng phương pháp hộp đổ. Ủ ở 30oC trong 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc hình thành
trên các đĩa môi trường.
Môi trường thuốc thử:
- Môi trường thạch T
- Dung dịch đệm phosphate được dùng để pha loãng mẫu trong các ống nghiệm 9mL/ống.
Các bước tiến hành: Bước 1: Cấy mẫu
+ Lấy 1mL dung dịch mẫu xét nghiệm 10-1,10-2,10-3… cho vào đĩa petri.
+ Cho vào từng đĩa 8-10mL môi trường thạch T đã được đun tan và làm nguội đến
45oC. Trộn đều mẫu và môi trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần.
+ Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt ngang.
+ Thời gian bắt đầu pha loãng mẫu đến khi rót môi trường không được quá 15 phút.
+ Ủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong 24 - 72giờ.
_____________________________________________________________________________________________________
Sau thời gian ủ ấm, tính kết quả bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy.
Bước 3: Tính kết quả
+ Chọn các hộp có số khuẩn lạc từ 25-300 đếm và tính trung bình của các nồng độ pha loãng tính ra số lượng vi khuẩn trong 1mL nước.
+ Tổng số vi khuẩn hiếu khí được tính theo công thức sau:
C= N/ (n*f)
Trong đó:
C : tổng số vi khuẩn trong 1mL nước (CFU/mL)
N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp chọn đếm. n : số hộp ở các nồng độ chọn đếm.
f : độ pha loãng ban đầu chọn đếm.
+ Đối chiếu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7045-2002 để xác định chất lượng mẫu kiểm nghiệm.
- Tổng số nấm men – nấm mốc
* Nguyên tắc:
Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khóm nấm mọc trên môi trường thạch Sabouraud sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ môi trường trong thời gian 3 – 5 ngày. Số lượng bào tử nấm mốc có trong 1g hay 1mL mẫu kiểm tra được tính từ số khóm nấm đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các độ pha loãng khác nhau.
* Môi trường: - Đệm phosphate - Thạch Sabouraud
* Quy trình xét nghiệm - Chuẩn bị dung dịch:
+ Pha loãng dung dịch đến các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, ...
+ Hút chính xác 1mL dung dịch mẫu thử cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9mL dung dịch đệm phosphate.
+ Hút chính xác 1mL dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9 mL
dung dịch đệm phosphate, trộn đều. Thu được dung dịch chứa 10-2.
+ Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-2,
10-3,…
- Cho 1mL mẫu vào đĩa, sau đó rót môi trường Sabouraud vào, trộn đều mẫu và môi trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần.
- Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt ngang.
- Thời gian bắt đầu pha loãng mẫu đến khi rót môi trường không được quá 30 phút.
- Ủ ở nhiệt độ môi trường xung quanh (khoảng 28 - 32oC) từ 3 – 5 ngày.
- Tính kết quả bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy.
- Đối chiếu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7045-2002 để xác định chất lượng mẫu kiểm nghiệm.
2.9 Đánh giá cảm quan
Phương pháp phân tích cảm quan và cho điểm dựa trên TCVN 3217:79
Lấy mẫu
- Lượng mẫu lấy theo yêu cầu của hội đồng cảm quan nhưng không quá 4 lít. - Mẫu phải bảo quản cho tới khi thử nghiệm ở nơi không có ánh sáng mặt trời chiếu thẳng vào và ở nhiệt độ không quá 250
C.
Tiến hành thử
Chuẩn bị mẫu
- Trước khi thử phải trộn mẫu ở bình thủy tinh.
- Khi kiểm tra nhiều mẫu thì bình đó phải được đánh dấu bằng số hoặc bằng chữ cái.
- Các mẫu được đưa ra phải giữ ở nhiệt độ không quá 200C trong suốt quá trình thử. Nhiệt độ được kiểm tra bằng nhiệt kế đặt trong mẫu so sánh.
_____________________________________________________________________________________________________
Tiến hành thử
Cho dịch thủy sâm mẫu vào đầy chai thủy tinh, chai đó đã được trắng bằng nước cất và mẫu thử nghiệm ngay sau đó kiểm tra độ trong và màu sắc dưới ánh sáng tự nhiên háy ánh sáng nhân tạo.
Khi kiểm tra nhiều mẫu thì bình đó phải được đánh dấu bằng số hoặc bằng chữ cái. Rót dịch thủy sâm mẫu vào khoảng một phần ba thể tích cốc thủy tinh, cốc đó đã được tráng bằng nước cất và mẫu thử nghiệm ngay sau đó tiến hành kiểm tra mùi, vị.
Sau khi cảm quan xong một mẫu phải nghỉ từ 5 – 10 phút. Cảm quan xong một phần hai số mẫu phải nghỉ từ 20 – 30 phút. Trong thời gian nghỉ, phải súc miệng bằng nước đã đun sôi để nguội không có mùi, vị lạ và dùng những thức ăn không ảnh hưởng đến vị giác để đưa cảm giác trở lại bình thường.
Khi cảm quan nhiều loại thủy sâm phải tiến hành theo thứ tự: Dịch thủy sâm không đường trước, dịch thủy sâm có đường sau và dịch Thủy sâm có nồng độ nhẹ trước, dịch thủy sâm có nồng độ mạnh sau, dịch thủy sâm ít chua trước, dịch thủy sâm chua nhiều sau. Số mẫu thử trong một ngày không quá 10 mẫu và không quá 3