- Năm mẫu thủy sâm được thu thập tại 3 tỉnh: Cần Thơ (H. Cờ Đỏ; P. Trà nóc; P. An Thới), Hậu Giang, Bến Tre.
- Phân lập nấm men
+ Pha loãng dịch thủy sâm đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch NaCl 0,85% rồi cấy trải trên môi trường YPD agar (yeast extract 1%, peptone 2%, D- glucose 2%, Agar 2%) bổ sung tetracyline 50mg/l
+ Chọn các khuẩn lạc nấm men có đặc điểm khác nhau cấy chuyển nhiều lần trên môi trường PGA (Khoai tây-glucose-agar). Kiểm tra độ ròng dưới kính hiển vi quang học, ghi nhận các đặc điểm hình thái về hình dạng, kích thước tế bào. Dòng thuần được trữ trên môi trường PGA ở 4°C
3.2.2. Tuyển chọn nấm men lên men ethanol mạnh trong môi trƣờng nƣớc trà
- Chủng các dòng nấm men đã phân lập vào ống nghiệm có chứa sẵn chuông
Durham và dịch đường glucose 2%, với mật số giống chủng 105 tế bào/mL, ủ ở nhiệt
độ môi trường xung quanh trong 24 giờ. Xác định thời gian và đo cột khí do nấm men sinh ra ở chuông Durham.
- Chủng các dòng nấm men đã phân lập vào bình tam giác chứa 100mL dịch nước
trà xanh 1% có bổ sung đường sucrose 20%, với mật số giống chủng 105 (tế bào/mL),
ủ ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong 05 ngày (3 lần lặp lại). Chưng cất xác định độ rượu sau lên men. Chọn dòng nấm men cho độ rượu cao nhất.
3.2.3. Khảo sát điều kiện thích hợp cho lên men thủy sâm Quy trình tổng quát: Quy trình tổng quát:
Trà ↓ Nấu lấy nước,
để nguội ↓
Phối chế ← Đường sucrose ↓
Thanh trùng ↓
Chủng giống
(Nấm men và vi khuẩn acid acetic) ↓
Ủ lên men ↓ Tồn trữ
Giải thích quy trình:
- Lá trà được nấu với nước theo tỉ lệ thí nghiệm trong 20
phút, sau đó để nguội và phối chế với đường sucrose, điều chỉnh pH về giá trị thí nghiệm.
- Dung dịch trà đường sau khi thanh trùng được phân phối
vào các bình thủy tinh và được chủng giống nấm men, sau đó để lên men ở các mức nhiệt độ và thời gian khác nhau theo từng thí nghiệm.
- Thành phẩm được tồn trữ ở các mức nhiệt độ và thời gian
khác nhau theo từng thí nghiệm.
a) Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ mật số giống chủng giữa nấm men và vi khuẩn acid acetic
Mục đích: Xác định mật số giống chủng nấm men và vi khuẩn acid acetic HG 3.1 để tăng hiệu suất lên men thủy sâm.
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố: + Mật số nấm men (tế bào/mL): 103, 104, 105, 106
+ Mật số vi khuẩn acid acetic (tế bào/mL): 103
, 104, 105, 106
Tổng số nghiệm thức = 4 mức độ mật số nấm men x 4 mức độ mật số vi khuẩn = 16 nghiệm thức. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Số đơn vị thí nghiệm: 3 x 16 = 48.
Chuẩn bị:
- Tăng sinh khối các dòng nấm men trên môi trường PGA lỏng trong vòng 24
giờ và vi khuẩn acid acetic trên môi trường YPGD lỏng bổ sung 0,5% CaCO3 và 4%
ethanol.
- Tiến hành pha loãng ở các nồng độ 10-1
, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 và đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu, chọn mật số phù hợp với nghiệm thức.
- Chuẩn bị 100 mL dịch nước trà 1%, bổ sung đường saccharose 20% theo từng
nghiệm thức.
Cách thực hiện:
Chủng vi khuẩn và nấm men theo mật số thí nghiệm vào mỗi 100 mL dịch nước trà 1%, bổ sung đường saccharose 20%, ủ ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong 07 ngày.
Các chỉ tiêu đánh giá
- Hàm lượng ethanol và acid sau quá trình lên men.
- Xử lý thống kê bằng chương trình MINITAB 16 và MICROSOFT OFFICE EXCEL 2003.
b) Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng và pH ban đầu
Mục đích: Xác định nồng độ đường và pH ban đầu thích hợp cho lên men thủy sâm. Bố trí thí nghiệm: - Thí nghiệm gồm 2 nhân tố: + Nồng độ đường (o Brix): 15, 20, 25, 30. + pH: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5.
Tổng số nghiệm thức = 4 mức độ nồng độ đường x 4 mức độ pH = 16 nghiệm thức. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Số đơn vị thí nghiệm: 3 x 16 = 48.
Chuẩn bị:
- Tiến hành tăng sinh và chuẩn bị tỉ lệ mật số nấm men và vi khuẩn acid acetic theo kết quả của thí nghiệm 3.2.3-a
- Chuẩn bị 100mL dịch trà có bổ sung đường, nồng độ trà, mức pH theo mỗi nghiệm thức, đựng trong bình tam giác 250mL và thanh trùng.
Cách thực hiện:
Chủng các dòng nấm men và vi khuẩn theo kết quả mật số - tỉ lệ giống chủng ở thí nghiệm 3.2.3-a vào 100mL dịch trà theo bố trí thí nghiệm. Điều chỉnh pH dịch trà bằng acid acetic. Ủ ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong 07 ngày.
Các chỉ tiêu đánh giá
- Hàm lượng ethanol và acid sau quá trình lên men.
- Xử lý thống kê bằng chương trình MINITAB 16 và MICROSOFT OFFICE EXCEL 2003.
c) Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian và nhiệt độ lên men
Mục đích: Xác định thời gian cùng nhiệt độ thích hợp cho lên men trà thủy sâm.
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố: + Thời gian (ngày): 3, 5, 7, 9 ngày
+ Nhiệt độ: 25o
C, 30oC và nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32o
C) Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Số đơn vị thí nghiệm: 4 mức độ thời gian x 3 mức độ nhiệt độ x 3 lần lặp lại = 36 nghiệm thức.
Chuẩn bị:
- Chuẩn bị 100mL dịch trà có nồng độ trà, bổ sung đường, được chỉnh pH theo kết quả của thí nghiệm 3.2.3-b cho mỗi nghiệm thức, dịch trà được chứa trong các bình
tam giác 250mL có nút gòn và đem đi khử trùng ở 121oC trong vòng 20 phút.
Cách thực hiện:
Chủng các dòng vi khuẩn acid acetic HG3.1 và nấm men BT21 theo kết quả mật số - tỉ lệ giống chủng ở thí nghiệm 3.2.1 vào mỗi bình tam giác chứa 100 mL dịch trà. Ủ ở các nhiệt độ và thời gian như bố trí thí nghiệm.
Các chỉ tiêu đánh giá
- Hàm lượng ethanol và acid sau quá trình lên men.
- Xử lý thống kê bằng chương trình MINITAB 16 và MICROSOFT OFFICE
EXCEL 2003.
3.2.4. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm sau lên men
Chất lượng sản phẩm lên men thủy sâm được đánh giá với các chỉ tiêu sau:
- Chỉ tiêu hóa học: + Hàm lượng ethanol + Hàm lượng acid tổng + Hàm lượng đường - Chỉ tiêu vi sinh vật: + Tổng số vi sinh vật hiếu khí + Tổng số nấm men + Tổng số nấm men nấm mốc
- Đánh giá chỉ tiêu cảm quan: Đánh giá thông qua hội đồng 10 thành viên, thang điểm 0-5, về các chỉ tiêu màu, mùi, vị, ý thích,..
3.2.5. Định danh các dòng nấm men đƣợc chọn
Mẫu nấm men được gửi định danh bằng phương pháp sinh học phân tử, giải trình tự đoạn ITS1, ITS2 và 5.8S rDNA và so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen để xác định loài và nấm men đã dùng. Đánh giá mức độ an toàn thực phẩm của loài nấm men này dựa trên các tài liệu tham khảo có liên quan.
CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đặc tính hình thái nâm men phân lập đƣợc
Nấm men được phân lập từ 05 mẫu thủy sâm ở từ 3 Tỉnh-Thành khác nhau: Cần Thơ (Cờ Đỏ, Trà Nóc và An Thới); Bến Tre và Hậu Giang. Kết quả đã phân lập được 23 dòng nấm men. Các dòng nấm men này có các hình dạng chủ yếu: ovan, cầu, ellip, dài. Kích thước tế bào có chiều dài 3-9µm, chiều rộng 3-6µm.
Các dòng nấm men được phân lập đa dạng về hình thái khuẩn lạc và hình dạng , kích thước tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi quang học (Vật kính E100), kết quả được ghi nhận ở Bảng 6.
Bảng 6. Đặc điểm hình thái của các dòng nấm men phân lập
STT Tên mẫu Địa phƣơng phân lập Mô tả huẩn lạc (trên môi trƣờng thạch PGD, sau 3 ngày ủ ở 30ºC) Đặc điểm tế bào 1. TN5 Trà Nóc Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 2-3mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi; bề mặt nhăn, khô; bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (5x3µm), hình ovan, nảy chồi nhiều hướng.
2. BT22 An Thới
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 2-4mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi bướu (umbonate); bìa chia thùy; màu trắng đục.
Tế bào nấm men nhỏ (6x3µm), hình elip, nảy chồi ở nhiều hướng.
3. TN7 Trà Nóc
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 4-6mm; chiều dày 0,1mm; khuẩn lạc nổi; bề mặt gợn sóng (curled), bìa chia thùy; màu trắng đục.
Tế bào nấm men hình dài, nối lại với nhau thành khuẩn ty giả (8x3µm), nảy chồi nhiều hướng.
4. BT28 An Thới
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 2-3mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi gò (pulvinat); bề mặt trơn, bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (6x3µm), hình elip, nảy chồi ở nhiều hướng.
5. HG6 Hậu Giang
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 3-5mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi lài (raised); bề mặt trơn, bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (4,5x3µm), hình elip, nảy chồi nhiều hướng.
6. TN3 Trà Nóc
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 2-3mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi lài (raised); bề mặt gợn sóng (curled), bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (4,5x3µm), hình ovan, nảy chồi ở một đầu.
7. BT21 An Thới
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 2-3mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi gò (pulvinat); bề mặt trơn; bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (6x6µm), hình cầu, nảy chồi ở một đầu.
8. CD1 Cờ Đỏ
Hình dạng khuẩn lạc không đều; đường kính 2mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi lài (raised); bề mặt trơn; bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (5x4,5µm), hình ovan, nảy chồi ở nhiều hướng.
9. HG4 Hậu Giang
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 3-5mm; chiều dày 1,5mm; khuẩn lạc nổi mô (convex); bề mặt trơn; bìa nguyên; màu trắng đục. Tế bào nấm men to (6,2x6µm), hình ovan, nảy chồi ở một đầu. 10. BT12 Bến Tre Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 2-3mm; chiều dày 1,5mm; khuẩn lạc nổi mô (convex); bề mặt nhăn; bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (6x3µm), hình ovan, nảy chồi nhiều hướng.
11. HG3 Hậu Giang
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 4mm; chiều dày 1,5mm; khuẩn lạc nổi hố (umbilicate); bề mặt nhăn; bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (4,5x3µm), hình dài, nảy chồi nhiều hướng.
12. BT201 An Thới
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 3-4,5mm; chiều dày 1,5mm; khuẩn lạc nổi hố (umbilicate); bề mặt nhăn; bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (4,5x3µm), hình ovan, nảy chồi nhiều hướng.
13. TN4 Trà Nóc
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 3-5mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi hố (umbilicate); bề mặt nhăn; bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (4,7x3µm), hình elip, nảy chồi nhiều hướng.
14. CD4 Cờ Đỏ
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 3-5mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi hố (umbilicate); bề mặt nhăn; bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (9x4,5µm), hình dai, nảy chồi ở một đầu.
15. HG1 Hậu Giang
Hình dạng khuẩn lạc không đều; đường kính 5-7mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi bướu
(umbonate); bìa chia thùy
(lobate); màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (4,5x3µm), hình ovan, nảy chồi nhiều hướng.
16. BT29 An Thới
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 4-6mm; chiều dày 1mm;
Tế bào nấm men to (6x3µm), hình dài, nảy
bìa răng cưa (erose); màu trắng đục.
17. BT24 An Thới
Hình dạng khuẩn lạc không đều; đường kính 5-7mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi bướu
(umbonate); bìa chia thùy
(lobate); màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (4,5x3µm), hình ovan, nảy chồi nhiều hướng.
18. HG5 Hậu Giang
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 3-5mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi gò (pulvinate); bề mặt nhẵn; bìa nguyên; màu trắng đục. Tế bào nấm men to (4x3µm), hình ovan, nảy chồi ở cực. 19. BT11 Bến Tre Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 5-7mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi bướu (umbonate); bìa răng cưa (erose); màu trắng đục. Tế bào nấm men to (3x2µm), hình ovan, nảy chồi ở một đầu. 20. BT25 An Thới Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 5-6,5mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi bướu (umbonate); bìa răng cưa (erose); màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (6x1,8µm), hình elip, nảy chồi nhiều hướng.
21. HG2 Hậu Giang
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 2-3,5mm; chiều dày 1.5mm; khuẩn lạc nổi hố (umbilicate); bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men to (4x3µm), hình ovan, nảy chồi nhiều hướng.
22. CD2 Cờ Đỏ
Hình dạng khuẩn lạc tròn, đường kính 2-3,5mm; chiều dày 1,5mm; khuẩn lạc nổi hố (umbilicate); bìa răng cưa (erose); màu trắng đục.
Tế bào nấm men hình ovan to (5x4µm), nảy chồi ở một đầu.
23. BT26 An Thới
Hình dạng khuẩn lạc tròn; đường kính 3-5mm; chiều dày 1mm; khuẩn lạc nổi hố (umbilicate); bề mặt nhăn; bìa nguyên; màu trắng đục.
Tế bào nấm men hình cầu lớn (6x6µm), nảy chồi ở một đầu.
Một số hình ảnh đại diện về khuẩn lạc và tế bào của một số dòng nấm men phân lập được trình bày trong Hình 10-19.
Hình 10. Khuẩn lạc BT22 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100
Hình 11. Khuẩn lạc TN7 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100
Hình 13. Khuẩn lạc BT21 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100
Hình 14. Khuẩn lạc HG4 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100
Hình 16. Khuẩn lạc BT201 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100
Hình 17. Khuẩn lạc BT24 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100
Hình 19. Khuẩn lạc HG2 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100
4.2. Tuyển chọn các dòng nấm men có hoạt tính ethanol cao trong môi trƣờng nƣớc trà trƣờng nƣớc trà
4.2.1. Khả năng sinh CO2
Các dòng nấm men được tăng sinh khối trong 24 giờ trong môi trường PGA broth tiếp tục được kiểm tra khả năng lên men trong dung dịch đường glucose 2%
trong chai Durham ở điều kiện nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32oC). Khả năng
lên men của các dòng nấm men phân lập được thể hiện qua chiều cao cột khí CO2 trong chai Durham và được đánh giá tại các thời điểm sau 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ, 16 giờ, 18 giờ, 20 giờ, 22 giờ, 24 giờ. Kết quả được trình bày trong Bảng 7.
Kết quả cho thấy, 23 dòng nấm men này không đồng nhất về khả năng lên men
trong dung dịch đường glucose. Chiều cao cột khí CO2 tăng dần theo thời gian do nấm
men biến dưỡng đường glucose và sinh CO2. Đa số các dòng nấm men bắt đầu lên men
sau 12 giờ (15/23 dòng).
Dòng nấm men BT21 bắt đầu lên men sớm nhất (sau 06 giờ) và sinh CO2 làm
đầy chuông Durham trong vòng 08 giờ. Dòng nấm men HG4 bắt đầu lên men sau 08
giờ và sinh CO2 làm đầy chuông sau 12 giờ. Bên cạnh đó, một số dòng vẫn chưa có
dấu hiệu lên men sau 24 giờ (HG1, TN5, TN7, TN3).
Trong quá trình lên men sản phẩm chính là rượu ethanol và CO2. Để xác định
hoạt lực của nấm men có thể dựa vào khả năng sinh khí CO2 trong quá trình lên men
(Nguyễn Đức Lượng, 2003). Vì vậy, có thể dựa vào thời gian làm đầy hết chuông Durham sớm nhất để xác định dòng nấm men BT21 có hoạt lực lên men mạnh nhất. Tuy nhiên, do thời gian lên men với ống Durham quá ngắn (24 giờ) trong khi đó quá
trình lên men rượu có thời gian dài hơn, nên phương pháp đo chiều cao cột khí CO2 chỉ