3.4.2.1: Khảo sát nồng độ enzyme pectinase và thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi dịch quả
Mục đích: Xác định tỷ lệ enzyme bổ sung và thời gian thủy phân để thu được
dịch xoài nhiều nhất để áp dụng cho các thí nghiệm sau.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm 2 nhân tố là A và B.
+ Nhân tố A: tỷ lệ enzyme có 4 mức độ (A1 = 0,1; A2 = 0,15, A3 = 0,2; A4 = 0,25 mL)
+ Nhân tố B: thời gian thủy phân có 4 mức độ (B1 = 20, B2 = 30, B3 =40, B4 = 50 phút)
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 2 nhân tố 8 mức độ 2 lần lặp lại = 32 đơn vị thí
nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm: Xoài sẽ được xay sơ bộ và được bố trí với 100g pure
??? xoài trong các bình tam giác để tiện cho quá trình quan sát. Bổ sung enzyme pectinase vào mỗi bình tam giác theo các mức độ khảo sát của nhân tố A và bố trí với
Xoài Thu nhận dịch xoài Pha chế dịch lên men Khảo sát dòng,tỉ lệ nấm men, pH,
độ Brix Lên men
Theo dõi thay đổi độ cồn, độ Brix Rượu vang xoài Đánh giá cảm quan Khảo sát tỉ lệ pectinase bổ sung Chọn các yếu tố tốt nhất Đưa ra quy trình sản xuất Lên men với
các điều kiện phù hợp
các mức thời gian thủy phân theo nhân tố B. Ở mỗi nghiệm thức được thực hiện với 2 lần lặp lại. Trong quá trình thực hiện thí nghiệm ngâm các bình tam giác trong nước
với nhiệt độ khoảng 40- 45oC để quá trình thủy phân diễn ra tốt hơn. Tiến hành vắt và
xác định thể tích dịch thu được ở mỗi nghiệm thức.
Chỉ tiêu theo dõi: lượng dịch xoài thu được.
3.4.2.2: Khảo sát khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập.
Mục đích: đánh giá khả năng lên men từ một số dòng nấm men đã được phân
lập. Nhằm chọn ra dòng nấm men có khả năng lên men mạnh nhất để lên men rượu
vang xoài đạt chất lượng cao.
Phương pháp thực hiện: Dùng phương pháp lên men trong chai Durham để
khảo sát khả năng lên men thông qua khả năng sinh khí CO2 và phương pháp lên men
trong bình tam giác sau đó tiến hành chưng cất để xác định đô cồn sau quá trình lên men.
3.4.2.2.1. Khảo sát khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập bằng phương pháp chai Durham
Mục đích: Đánh giá khả năng lên men của các dòng nấm men bằng phương
pháp lên men trong chai Durham.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm 1 nhân tố là 11 dòng nấm men, bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 11 nghiệm thức, 3 lần lặp lại (3 ống nghiệm).
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 11 dòng nấm men 3 lần lặp lại = 33 đơn vị thí
nghiệm.
Cánh tiến hành:
- Chuẩn bị giống nấm men: nấm men được giữ trong tủ lạnh, tiến hành cấy kích
hoạt nấm men trên môi trường PGA, ủ ở tủ ủ 30oC trong 24 giờ trước khi nuôi tăng
sinh.
- Nuôi tăng sinh nấm men: Nuôi 11 dòng nấm men trên trong cùng một môi trường PG lỏng có bổ sung 1% yeast extract.
- Sau khi nhân giống tiến hành kiểm tra mật số nấm men bằng phương pháp đếm trực tiếp với buồng đếm hồng cầu, tiến hành pha loãng cho các dòng nấm men có mật
số tương đương nhau khoảng 107 tế bào/mL (để chủng 1 mL vào 9 mL dịch xoài để
đạt mật số chủng 106 tế bào/mL).
- Bổ sung 9mL dịch ép vào chai Durham, đo độ Brix, pH ban đầu của dịch ép. - Hút 1mL dung dịch nấm men cho vào chai Durham chứa dung dịch thí nghiệm.
- Lắc đều và ủ ở nhiệt độ khoảng 30oC.
- Đo cột khí trong chai Durham tại các thời điểm lên men.
Các yếu tố cố định
- Hàm lượng dịch trước khi lên men: 9mL dịch xoài
- Tỷ lệ nấm men: 1mL nấm men ở nồng độ 107
- Nhiệt độ của quá trình lên men: 30oC.
Chỉ tiêu theo dõi
Tốc độ lên men, khả năng sinh CO2 được ghi nhận bằng cách đo chiều cao cột khí
CO2 tại từng thời điểm của quá trình lên men, cách 2 giờ sẽ tiến hành đo chiều cao cột
khí/lần trong 24 giờ.
3.4.2.2.2. Khảo sát khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập bằng
phương pháp lên men trong bình tam giác
Mục đích thí nghiệm: xác định chủng nấm men có khả năng lên men mạnh nhất.
Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm 1 nhân tố là 11 dòng nấm men, bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 11 nghiệm thức, 3 lần lặp lại (3 bình tam giác).
- Tổng số đơn vị thí nghiệm: 11 dòng nấm men 3 lần lặp lại = 33 đơn vị thí nghiệm.
Cách tiến hành
Với 11 dòng nấm men đã được phân lập và tách ròng.
- Chuẩn bị giống nấm men: 11 dòng nấm men được giữ trong tủ lạnh, tiến hành cấy
kích hoạt nấm men trên môi trường PGA, ủ ở tủ ủ 30oC trong 24 giờ trước khi nuôi
tăng sinh.
- Nuôi tăng sinh nấm men: Nuôi 11 dòng nấm men trên trong cùng một môi trường PG lỏng có bổ sung 1% yeast extract.
- Chuẩn bị dịch lên men: áp dụng kết quả từ thí nghiệm 1, tiến hành thu dịch xoài đo độ Brix, pH ban đầu của dịch ép, chỉnh đến pH, độ Brix phù hợp để thực hiện thí nghiệm.
- Sau khi nhân giống tiến hành kiểm tra mật số nấm men bằng phương pháp đếm trực tiếp với buồng đếm hồng cầu, tiến hành pha loãng cho các dòng nấm men có mật
số tương đương nhau khoảng 108 tế bào/mL (để chủng 1 mL vào 99 mL dịch xoài để
đạt mật số chủng 106 tế bào/mL).
- Bổ sung 99 mL dịch ép vào bình tam giác.
- Hút 1mL dung dịch nấm men vào bình tam giác có chứa dung dịch thí nghiệm.
- Lắc đều và ủ ở nhiệt độ khoảng 30oC.
Các yếu tố cố định
- Hàm lượng dịch trước khi lên men: 99 mL dịch xoài - pH ban đầu: 4.70.
- Brix ban đầu: 22.
- Tỷ lệ nấm men: 1mL nấm men ở nồng độ 108.
- Nhiệt độ của quá trình lên men: 30oC.
Chỉ tiêu theo dõi
- pH, Brix trước và sau lên men. - Độ cồn sau khi lên men.
- Tốc độ lên men, khả năng sinh CO2.
Từ kết quả 2 thí nghiệm trên, tuyển chọn được dòng nấm men có hoạt tính lên
men mạnh nhất, để tiến hành ở các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.3: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch xoài lên quá trình lên men
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1 nhân tố, bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 nghiệm thức: 100% dịch xoài nguyên chất; 3 dịch xoài: 1 nước; 2 dịch xoài: 1 nước; 1 dịch xoài: 1 nước; 1 dịch xoài: 2 nước), 3 lần lặp lại.
Tổng đơn vị thí nghiệm: 5 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 15 đơn vị thí nghiệm.
Dịch quả sau khi thu được pha chế với nước cất để đạt các nồng độ như bố trí thí nghiệm, được cho vào các bình tam giác đã vô trùng, sau đó bổ sung vào 1mL chủng
nấm men (N3) với mật độ là 108 tế bào/mL (để khi chủng vào 99 mL dịch xoài đạt mật
số 106 tế bào/mL).
Các yếu tố cố định
- Thời gian lên men: 7 ngày
- Dòng nấm men: dòng N3
- Mật số chủng: 108 tế bào/mL
- pH ban đầu là: 4.20
- Brix ban đầu là: 23
- Nhiệt độ của quá trình lên men: 30oC
Chỉ tiêu theo dõi
- pH, Brix trước và sau lên men.
- Độ cồn sau khi lên men.
- Tốc độ lên men, khả năng sinh CO2.
Mục đích: xác định được tỷ lệ pha loãng thích hợp cho quá trình lên men giúp
giảm giá thành và đạt hiệu quả kinh tế cao.
3.4.2.4: Khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm men, độ Brix và pH ban đầu đến quá trình lên men rượu xoài.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số với 3 nhân tố, 3
mức độ và 2 lần lặp lại
Nhân tố E: Độ Brix với 3 mức độ:
E1= 22 E2 = 25 E3 = 28
Nhân tố F: Độ pH với 3 mức độ:
F1 = 3,9 F2 = 4.2 F3 = 4.5
Nhân tố G: tỷ lệ nấm men với 3 mức độ:
G1 = 103 G2 = 105 G3 = 107
Tổng số nghiệm thức là 3 x 3 x 3 = 27, tổng số đơn vị thí nghiệm là 27 x 2 = 54.
Cho vào mỗi bình tam giác 100mL dịch lên men, đo pH và độ Brix của dịch quả sau đó điều chỉnh độ Brix bằng cách bổ sung đường và điều chỉnh pH bằng cách bổ
sung NaHCO3 và acid citric theo các giá trị như bố trí thí nghiệm. Thanh trùng bằng
NaHSO3 trong 2 giờ trong tủ cấy và sau đó chủng nấm men (nhân tố F) vào một cách
ngẫu nhiên theo bố trí thí nghiệm. Lên men 7 ngày ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau khi lên men xong tiến hành đo pH, Brix sau lên men, chưng cất và đo độ rượu. Từ những kết quả thu được tiến hành phân tích phương trình hồi quy để tuyển chọn được tổ hợp nghiệm thức đạt giá trị tố ưu, để áp dụng cho thí nghiệm sau.
100 mL dịch xoài
Brix pH Mật số
22 25 28 3,9 4,2 4,5 103 105 107
Lên men 7 ngày
Đo pH, Brix, chưng cất đo độ rượu
Phân tích giá trị: pH, Brix, mật số thích hợp
Hình 6: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng các nhân tố mật số nấm men, độ Brix và pH đến quá trình lên men rượu
Các chỉ tiêu theo dõi:
- pH trước và sau lên men bằng pH kế
- Nồng độ đường trước và sau lên men đo bằng Brix kế
- Độ rượu tạo ra sau khi lên men (chưng cất, đo độ rượu với cồn kế, quy về độ rượu ở 20oC)
Tiến hành đánh giá cảm quan để kiểm tra chất lượng sản phẩm
Sau khi đánh giá tất cả các chỉ tiêu ta chọn ra nghiệm thức tổ hợp nghiệm thức phù hợp về độ Brix, pH và mật số nấm men thích hợp nhất để lên men rượu vang. Tiến hành một thí nghiệm nhỏ để kiểm tra và đánh giá sản phẩm rượu tạo thành.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm có 4 nhân tố (tỷ lệ pha loãng dịch ép, dòng nấm men, độ Brix, pH, mật số nấm men) 1 mức độ (giá trị phù hợp nhất) × 2 lần lặp lại = 2 đơn vị thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm:
Sử dụng kết quả từ các thí nghiệm 1, 3, 4 để chuẩn bị dịch xoài.
Ép sơ bộ thu pure xoài áp dụng tỷ lệ và thời gian thủy phân của enzyme
pectinase từ thí nghiệm 1 để thu dịch xoài.
Bổ sung nước theo tỷ lệ ở thí nghiệm 3
Đo pH và độ Brix ban đầu của dịch quả sau đó điều chỉnh độ Brix bằng cách bổ
sung đường và điều chỉnh pH bằng NaHCO3 và acid citric đến giá trị đã được
thực hiện ở thí nghiệm 4 có độ rượu cao.
Thanh trùng dịch xoài bằng NaHSO3 trong 2 giờ và sau đó chủng dòng nấm
men lên men tốt nhất ở thí nghiệm 2 với mật số tìm ra ở thí nghiệm 4. Lên men 7 ngày ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau khi lên men xong ly tâm và tiến hành đánh giá cảm quan.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- pH, độ Brix trước và sau lên quá trình lên men. - Độ rượu của sản phẩm tạo thành
Sau khi đánh giá các chỉ tiêu, tiến hành đánh giá chất lượng của sản phẩm thông qua: Phương pháp phân tích cảm quan và cho điểm theo tiêu chuẩn TCVN 3217:79 (phụ lục 5). Dựa trên kết quả đánh giá để xác định chất lượng và yêu cầu đối với sản phẩm để góp phần hoàn thiện sản phẩm về sau.
Mục đích: Đánh giá được chất lượng, xếp loại mẫu rượu và kiểm tra các chỉ tiêu về độ
trong và màu sắc, mùi, vị từ đó có thể điều chỉnh để phù hợp về khẩu vị cũng như để
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Nồng độ enzyme pectinase và thời gian thủy phân đến khả năng thu hồi dịch quả.
Sau quá trình khảo sát nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến khả năng thu hồi dịch quả ta thu được những kết quả sau (Bảng 10):
Bảng 10: Lượng dịch thu được sau quá trình khảo sát nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến khả năng thu hồi dịch quả
Thời gian (phút) Tỷ lệ enzyme pectinase (mL) Lượng dịch thu được (mL)
20 0,10 80,25g 0,15 82,50ef 0,20 84,75cd 0,25 88,00b 30 0,10 85,50cd 0,15 87,75b 0,20 85,25cd 0,25 85,50cd 40 0,10 81,50fg 0,15 90,25a 0,20 86,50bc 0,25 84,75cd 50 0,10 82,75ef 0,15 85,00cd 0,20 84,25de 0,25 80,50g CV (%) 3,27
*Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại.
Hình 9: Biểu đồ thể hiện lượng dịch thu được ở tất cả các nghiệm thức
Khi quan sát biểu đồ thể hiện tỷ lệ enzyme và lượng dịch thu được ở từng mức
thời gian ta thấy với những khoảng thời gian khác nhau thì hoạt động thủy phân của các nồng độ enzyme khác nhau. Như vậy thời gian có ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme trên cơ chất là dịch xoài.
Với thời gian thủy phân là 20 phút thì nồng độ enzyme là 0,25 mL đạt giá
trị cao nhất là 88 mL.
Với thời gian thủy phân là 30 phút thì các nồng độ enzyme đều đạt giá trị
tương đương nhau, nhưng cao nhất là 0,15 mL với 87,75 mL.
Với thời gian thủy phân là 40 phút thì các nồng độ enzyme khác biệt tương
đối lớn cụ thể ở nồng độ 0,15 mL ta thu được lượng dịch là 90,25 mL trong khi ở các nồng độ 0,1; 0,2; 0,25 mL ta lần lượt thu được lượng dịch là: 81,5; 86,5; 84,75 mL.
Với thời gian thủy phân là 50 phút hầu như ở tất cả nghiệm thức thì lương
dịch thu được đều giảm so với thời gian thủy phân là 40 phút, riêng ở nghiệm thức 0,1 mL thì lượng dịch tăng lên nhưng tăng thấp.
Từ kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ 0,15 mL enzyme pectinase ở 40 phút ta thu được lượng dịch quả nhiều nhất 90,25 mL.
Kết quả thí nghiệm cho thấy hai yếu tố thời gian và nồng độ, ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme pectinase trên dịch xoài. Vì vậy tùy theo thời gian cho phép ta có thể lựa chọn nồng độ enzyme phù hợp cho mức thời gian đó để thu được lượng dịch xoài nhiều nhất.
Hai nghiệm thức là 0,15 mL ở 40 phút và 0,25 mL ở 20 phút ta thu được lượng
dịch tương đương nhau là 90,25 mL và 88 mL. Tuy nhiên, ở nồng độ 0,25 mL ta rút ngắn được thời gian thủy phân là 20 phút tuy nhiên lượng dịch thu được là 88 mL thấp hơn so với nồng độ 0,15 mL.
Nồng độ 0.15 mL enzyme pectinase ở thời gian thủy phân là 40 phút thì phù
hợp để thu được lượng dịch xoài nhiều nhất và với nồng độ enzyme sử dụng thấp là 0,15 mL giúp làm giảm chi phí cho nguyên liệu do giá thành của enzyme tương đối cao. Kết quả này sẻ được áp dụng cho các thí nghiệm sau cũng hoàn toàn phù hợp để
áp dụng vào các quy trình sản xuất.
2. Khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập trong quá trình lên men dịch xoài.
2.1. Khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập trong chai Durham.
Theo Lương Đức Phẩm (1998) trong quá trình sống, nấm men sinh ra một lượng
CO2 khá lớn. Sản phẩm này được tạo thành từ quá trình hô hấp hiếu khí và kỵ khí của
nấm men. Trong điều kiện kỵ khí, ngoài sinh ra rượu etylic nấm men còn sản sinh ra
lượng CO2 và các sản phẩm phụ khác. Lượng CO2 sinh ra sẽ đẩy ống Durham nên cột
khí CO2 sinh ra là một trong những yếu tố để xác định sự lên men mạnh hay yếu.
Qua kết quả thí nghiệm và Bảng 11, lượng CO2 sinh ra ở các nghiệm thức là khác