- Cho 15ml mơi trƣờng lỏng NFb, New và Burk vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ƣớt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuơi cấy các dịng vi khuẩn trên máy lắc 200 vịng/phút.
d. Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 và 8 (sau khi chủng)
- Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hịa tan thêm nƣớc cất vào đến 0,5l.
- Pha buffer: cho 1ml NaOCl cĩ nồng độ (5 – 5,25 %) và 5 g NaOH vào 0,5l nƣớc cất.
- Pha đƣờng chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm
+ Đƣờng chuẩn 0 ppm gồm cĩ: 5ml H2O, 0ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đƣờng chuẩn 1 ppm gồm cĩ: 4ml H2O, 1ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đƣờng chuẩn 2 ppm gồm cĩ: 3ml H2O, 2ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đƣờng chuẩn 3 ppm gồm cĩ: 2ml H2O, 3ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đƣờng chuẩn 4 ppm gồm cĩ: 1ml H2O, 4ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đƣờng chuẩn 5 ppm gồm cĩ: 0ml H2O, 5ml NH4+, 5ml buffer, 5 ml thuốc thử
- Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
+ Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. + Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 10 phút.
+ Hút 1ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD.
+ Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bƣớc sĩng 636nm, sau đĩ vẽ đồ thị trên Excel cĩ thể tính đƣợc nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.
3.2.5 Xác định khả năng hịa tan lân
- Chuẩn bị mơi trƣờng NBRIP (Nautiyal, 1999). ( Bảng 1)
- Hút 5μl vi khuẩn nhỏ lên bề mặt mơi trƣờng.
- Ủ 30°C trong 12h – 24h.
- Quan sát khả năng tạo vịng halo. Đo đƣờng kính halo và khuẩn lạc mỗi ngày
- Hiệu quả hịa tan lân E đƣợc tính theo cơng thức 100 lạc khuẩn kính Đường halo kính Đường E (C. NGUYEN và ctv, 1992) 3.2.6 Xác định khả năng tổng hợp IAA a. Chuẩn bị
- Chuẩn bị các dịng vi khuẩn đã tách rịng và mơi trƣờng NFb lỏng.
- Cho 15ml mơi trƣờng lỏng NFb vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ƣớt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuơi cấy các dịng vi khuẩn trên máy lắc 200 vịng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dƣới ánh sáng)
b. Hĩa chất
- Thuốc thử: 4,5g FeCl3 trong 1 lít dd H2SO4 - Buffer
+ Dung dịch A2: 0,136g KH2SO4 trong 100ml nƣớc cất. + Dung dịch B2: 0,174g K2HSO4 trong 100ml nƣớc cất.
c. Phương pháp
- Lấy 39ml dung dịch A2, 61ml dung dịch B2 cho thêm nƣớc cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH = 7
- Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. - Ly tâm 5500 vịng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham.
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hồn tồn sau đĩ đo quang phổ OD ở bƣớc sĩng 530nm.
- Chuẩn bị đƣờng chuẩn IAA: Cân 0,0016g IAA thƣơng mại hịa tan với 10ml phosphat buffer đƣợc nồng độ là 160µg/l. Sau đĩ pha lỗng ra các nồng độ 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/ml.
- Kết quả đo phổ OD vẽ thành đƣờng chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD cĩ giá trị từ 0 – 3. Trục hồnh là nồng độ IAA cĩ giá trị từ 0 – 40µg/ml.
- Kết quả đo OD các dịng vi khuẩn phân lập đƣợc thay vào phƣơng trình đồ thị đƣờng chuẩn, từ đĩ tính đƣợc nồng độ IAA đã đƣợc vi khuẩn tổng hợp.
3.2.7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn
- Chuẩn bị mơi trƣờng LB ( Lauria Betani)
- Hút 50µl dung dịch pha lỗng của vi khuẩn gây bệnh (E. coli, A. hydrophila) trải lên bề mặt đĩa mơi trƣờng.
- Dùng giấy thấm đƣờng kính 6mm nhúng vào dung dịch vi khuẩn trong vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt mơi trƣờng đã trải vi khuẩn gây bệnh.
- Ủ 30°C trong 12h – 24h. Quan sát khả năng tạo vịng kháng khuẩn.
- Đo đƣờng kính khuẩn lạc (d) và đƣờng kính vịng (D) sáng 3 ngày liên tiếp. - Đƣờng kính vịng vơ khuẩn đƣợc tính bằng cơng thức:
Đƣờng kính vịng vơ khuẩn = D – d (Ngơ Thị Phƣơng Dung et al., 2011)
3.2.8 Nhận diện một số dịng vi khuẩn nội sinh trình vọng
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn đã phân lập đƣợc, chọn một số dịng vi khuẩn cĩ khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn cao để thực hiện phƣơng pháp PCR.
Quy trình trích ADN nhanh theo phƣơng pháp của Barberio và Fani (1998).
- Cấy vi khuẩn từ ống trữ rịng lên đĩa Petri chứa mơi trƣờng LB. Ủ 24h trong tủ ủ ở 30°C.
- Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf
Dung dich pha lỗng của
vi khuẩn gây bệnh Đĩa mơi trƣờng LB Hút 50µl trải
lên đĩa
Đặt giấy thấm đã nhúng vi khuẩn đƣợc phân lập từ cây Diếp Cá lên đĩa vừa trải Ủ 12 – 24h
Quan sát sự xuất hiện vịng vơ khuẩn
Hình 7: Quy trình thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn nội sinh trên Diếp Cá. (Hình vẽ, ngày 20-11-2013)
- Ly tâm nhẹ hai lần. Thu đƣợc dịch trích ADN của vi khuẩn. - Đem trữ ở -20°C nếu chƣa tiến hành quy trình PCR.
Nhận diện các dịng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
- Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng) (Bảng 7). Quy trình PCR
- Biến tính DNA ở 95°C trong 5 phút.
- Tiếp theo là 3 chu trình đƣợc gia nhiệt nhƣ sau: + 95°C trong 1 phút
+ 49°C trong 1 phút + 72°C trong 1 phút
- Bƣớc cuối cùng là 72°C trong 10 phút.
- Sản phẩm PCR sau đĩ đƣợc trữ lạnh ở -20°C để điện di - Điện di gel agarose sản phẩm PCR
- Sản phẩm DNA sau khi trích, đƣợc tiến hành khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sai đĩ kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% cĩ chứa ethidium bromide. Sản phẩm gel sau khi điện di đƣợc chụp bằng máy chụp hình gel Bio – Rad UV 2000 (Hoa Kỳ)
- Chuẩn bị gel nhỏ : (20ml) + Agarose (1%): 0,2g + TAE buffer (1X): 20ml
- Nấu 2 phút cho tan Agarose trong lị vi sĩng (microwave) - Sau khi nấu để nguội khoảng 50 – 60°C, bổ sung EtBr 0,4μl
- Rĩt gel vào khuơn. Sau khi rĩt gel vào khuơn khoảng 90 phút ta tiến hành load mẫu.
- Load mẫu: dùng Micropipet hút 10μl Loading Buffer (LB) chia làm 4 giọt trên giấy parafilm. Hút 10μl mẫu DNA vi khuẩn, trộn với giọt Loading Buffer trên và load mẫu vào giếng.
- Điện di 60 phút ở 90V. Chụp hình gel bằng máy chụp gel Bio – Rad.
Dùng phần mềm Microsoft Excel để nhập và xử lý số liệu và phần mềm Minitab để phân tích thống kê.
CHƢƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập vi khuẩn từ cây Diếp Cá.
4.1.1 Phân lập các dịng vi khuẩn.
Sau khi hút chuyển 10μl dịch trích vào ống nghiệm chứa mơi trƣờng NFb bán đặc, và đƣợc ủ từ 2 đến 3 ngày, các dịng vi khuẩn phân lập từ rễ, thân và lá của cây Diếp Cá đều sinh trƣởng và phát triển tốt trong điều kiện vi hiếu khí. Sự phát triển này tạo thành 1 vịng pellicle trắng đục bên dƣới mơi trƣờng ống NFb bán đặc khoảng 2,0 – 6,0mm. Lớp màng này đặc trƣng cho sự phát triển của vi khuẩn nội sinh.
(Hình chụp, ngày 16-9-2013)
Qua quá trình phân lập và tách rịng các dịng vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá
Vịng pellicle
Hình 8: Sự phát triển của vi khuẩn tạo vịng pellicle trong mơi trƣờng NFb bán đặc
Bảng 8: Kết quả phân lập các dịng vi khuẩn từ rễ, thân và lá của cây Diếp Cá
STT Tên dịng vi khuẩn Vị trí phân lập
1 R1 Rễ 2 R2 Rễ 3 R3 Rễ 4 R4 Rễ 5 R5 Rễ 6 R6 Rễ 7 T1 Thân 8 T2 Thân 9 T3 Thân 10 T4 Thân 11 T5 Thân 12 T6 Thân 13 L1 Lá 14 L2 Lá 15 L3 Lá 16 L4 Lá 17 L5 Lá 18 L6 Lá 19 L7 Lá 20 L8 Lá
Kết quả phân lập đƣợc 20 dịng vi khuẩn, trong đĩ cĩ 6 dịng vi khuẩn phân lập từ Rễ (chiếm 30%), 6 dịng vi khuẩn phân lập từ Thân (chiếm 30%) và 8 dịng vi khuẩn phân lập từ Lá (chiếm 40%).
4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc của 20 dịng vi khuẩn
Đa số các dịng đều cĩ màu trắng đục, cịn lại cĩ màu trắng trong, trắng ngà, nâu và vàng. Khuẩn lạc đa số dạng trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ hoặc lài. Đƣờng kính khuẩn lạc thay đổi từ 0,5mm đến 4,5mm sau 1 ngày nuơi cấy trên mơi trƣờng PDA (Bảng 9).
Bảng 9: Đặc điểm của 20 dịng vi khuẩn đã đƣợc phân lập
STT Dịng vi
khuẩn Hình dạng Màu sắc Độ nổi Dạng bìa Kích thƣớc khuẩn lạc (mm)
1 R1 Trịn Vàng Mơ Nguyên 4,5
2 R2 Trịn Vàng Mơ Răng cƣa 2,5
3 R3 Trịn Trắng đục Mơ Nguyên 4
4 R4 Trịn Trắng ngà Mơ Nguyên 4
5 R5 Trịn Trắng trong Mơ Nguyên 1
6 R6 Trịn Trắng đục Mơ Nguyên 1
7 T1 Trịn Trắng đục Lài Nguyên 1
8 T2 Trịn Trắng trong Mơ Nguyên 1,5
9 T3 Trịn Vàng Lài Răng cƣa 4
10 T4 Trịn Trắng đục Lài Nguyên 2
11 T5 Trịn Trắng đục Mơ Nguyên 0,5
12 T6 Khơng Đều Nâu Lài Răng cƣa 5
13 L1 Trịn Trắng đục Mơ Nguyên 5
14 L2 Trịn Trắng đục Mơ Nguyên 3,5
15 L3 Trịn Trắng ngà Mơ Nguyên 4,5
16 L4 Trịn Trắng ngà Lài Nguyên 4
17 L5 Trịn Nâu Lài Răng cƣa 3
Hình dạng khuẩn lạc:
+ 18/20 dịng vi khuẩn cĩ dạng khuẩn lạc hình trịn (chiếm 90%). + 2/20 dịng vi khuẩn cĩ dạng khuẩn lạc khơng đều (chiếm 10%). Màu sắc khuẩn lạc:
+ 8/20 dịng vi khuẩn cĩ khuẩn lạc màu trắng đục (chiếm 40%). + 4/20 dịng vi khuẩn cĩ khuẩn lạc màu trắng ngà (chiếm 20%). + 2/20 dịng vi khuẩn cĩ khuẩn lạc màu trắng trong (chiếm 10%). + 3/20 dịng vi khuẩn cĩ khuẩn lạc màu vàng (chiếm 15%). + 3/20 dịng vi khuẩn cĩ khuẩn lạc màu nâu (chiếm 15%). Độ nổi khuẩn lạc:
+ 11/20 dịng vi khuẩn cĩ độ nổi khuẩn lạc dạng mơ (chiếm 55%). + 9/20 dịng vi khuẩn cĩ khuẩn lạc dạng lài (chiếm 45%).
Dạng bìa khuẩn lạc:
+ 13/20 dịng vi khuẩn cĩ khuẩn lạc bìa nguyên (chiếm 65%). + 7/20 dịng vi khuẩn cĩ khuẩn lạc bìa răng cƣa (chiếm 35%).
4.1.3 Hình dạng và khả năng di chuyển của 20 dịng vi khuẩn
Các dịng vi khuẩn chủ yếu ở dạng que ngắn ngồi ra cịn cĩ vi khuẩn dạng que dài, que ngắn kết chuỗi, que dài kết chuỗi, cầu đơi và cầu. Xét về khả năng di chuyển thì tất cả các dịng vi khuẩn đều chuyển động. (Bảng 10).
Bảng 10: Đặc tính của 20 dịng vi khuẩn
STT Dịng vi khuẩn Hình dạng
Kích thƣớc vi khuẩn rộng x dài (µm)
Di chuyển Hình 9: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên mơi trƣờng PDA
3 R3 Que dài 5,301 x 0,684 + 4 R4 Que dài 5,13 x 0,855 ++ 5 R5 Que ngắn 2,052 x 0,513 + 6 R6 Que ngắn 1,539 x 0,855 ++ 7 T1 Que dài 9,405 x 1,71 ++ 8 T2 Que ngắn 1,881 x 0,342 ++ 9 T3 Que ngắn – chuỗi 2,052 x 0.855 + 10 T4 Que ngắn 1,71 x 0,855 ++ 11 T5 Que ngắn 2,565 x 0,855 ++ 12 T6 Que ngắn – chuỗi 3,591 x 1,026 ++ 13 L1 Que ngắn 3,249 x 1,539 +
14 L2 Que dài – chuỗi 5,13 x 1,197 ++
15 L3 Que ngắn 3,42 x 1,539 +
16 L4 Que ngắn 4,275 x 1,71 ++
17 L5 Cầu đơi 2,565 x 1,026 +
18 L6 Que dài 6,84 x 1,026 +
19 L7 Que dài – chuỗi 5,13 x 1,197 +
20 L8 Que ngắn – chuỗi 1,71 x 1,368 ++
Ghi chú:
(+): chuyển động chậm (++): chuyển động nhanh
- Hình dạng vi khuẩn: trong 20 dịng vi khuẩn phân lập đƣợc đa số vi khuẩn đều cĩ dạng hình que, trong đĩ :
+ 4 dịng que dài (chiếm 20%). + 8 dịng que ngắn (chiếm 40%). + 2 dịng que dài – chuỗi (chiếm 10%).
+ 4 dạng que ngắn – chuỗi (chiếm 20%). + 1 dạng cầu đơi (chiếm 5%).
+ 1 dạng hình cầu (liên cầu) (chiếm 5%).
- Khả năng chuyển động: tất cả 20/20 dịng vi khuẩn phân lập đƣợc đều cĩ khả năng chuyển động (chiếm 100%), trong đĩ cĩ:
+ 11 dịng cĩ khả năng chuyển động nhanh (chiếm 55%). + 9 dịng cĩ khả năng chuyển động chậm (chiếm 45%).
4.1.4 Kết quả nhuộm Gram của 20 dịng vi khuẩn.
Trong 20 dịng vi khuẩn phân lập đƣợc, qua quá trình nhuộm Gram và quan sát dƣới kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 400 lần đã xác định đƣợc:
Vi khuẩn gram âm chiếm đa số với 16 dịng (chiếm 80%). Vi khuẩn gram dƣơng cĩ 4 dịng (chiếm 20%).
Bảng 11: Kết quả nhuộm Gram của 20 dịng vi khuẩn.
STT Dịng vi khuẩn Gram 1 R1 + 2 R2 + 3 R3 - 4 R4 - 5 R5 - 6 R6 - 7 T1 - 8 T2 -
11 T5 - 12 T6 - 13 L1 - 14 L2 - 15 L3 + 16 L4 - 17 L5 - 18 L6 - 19 L7 - 20 L8 -
Ghi chú: (-): gram âm (+): gram dương
Hình A: Gram âm. Hình B: Gram dƣơng.
Hình 10: Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn
(Hình chụp, ngày 14-11-2013)
4.2 Khả năng tổng hợp NH4+.
Khảo sát khả năng cố định đạm dựa vào lƣợng NH4+ (ammonium) do vi khuẩn sinh ra. Kết quả là 20/20 dịng vi khuẩn phân lập đƣợc đều cĩ khả năng sinh ra NH4+ (chiếm 100%)
Khả năng cố định đạm của các dịng vi khuẩn đƣợc thể hiện qua mức độ hấp thụ quang phổ của các mẫu đo. Những mẫu cĩ màu xanh càng đậm thì cĩ độ hấp thụ quang phổ càng lớn và khả năng tổng hợp amonium càng cao.
Mỗi mẫu đo đƣợc lặp lại 3 lần, sau đĩ tính giá trị trung bình của 3 lần đo sau ngày 2, ngày 4, ngày 6 và ngày 8, kết quả thu đƣợc nhƣ trong phụ lục 1.
Hai mƣơi dịng vi khuẩn phân lập đƣợc trên mơi trƣờng PDA đƣợc chia ra thành 3 nhĩm Rễ, Thân và Lá để khảo sát lƣợng NH4+ do vi khuẩn tạo ra ở ngày 2, 4, 6 và 8 (sau khi chủng trong mơi trƣờng NFb lỏng, khơng N, khơng Yeast extract).
Hàm lƣợng NH4+ ở tất cả 20 dịng đều tăng dần từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4 và cao nhất vào ngày thứ 6. Sau đĩ hàm lƣợng NH4+ lại giảm mạnh vào ngày thứ 8.
Hình 11: Phản ứng màu của đƣờng chuẩn NH4+.
4.2.1 So sánh khả năng tạo NH4+ của các dịng vi khuẩn phân lập từ Rễ.(R1 – R6)
Sau 2 ngày chủng, các dịng vi khuẩn R1 – R6 đã tạo đƣợc một lƣợng NH4+ nhất định. Lƣợng NH4+
nhiều nhất ở dịng R1, khác biệt cĩ ý nghĩa so với các dịng cịn lại và 2 dịng R3 , R6 là những dịng cĩ lƣợng NH4+ tổng hợp ít nhất. (hình 12)
Ghi chú: Trị trung bình cĩ các mẫu tự đầu cột giống nhau biểu thị sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,5).
Đến ngày thứ 4 thì đa số các dịng vi khuẩn R1 – R6 đều cĩ lƣợng NH4+ tổng hợp khá cao so với ngày 2 (hình 12). Trong đĩ R1 và R3 là 2 dịng vi khuẩn sinh ra lƣợng NH4+ nhiều nhất với lƣợng NH4+ đƣợc tạo ra lần lƣợt là 0,659μg/ml và 0,628μg/ml khác biệt cĩ ý nghĩa so với 4 dịng cịn lại. Ở ngày 4 thì lƣợng NH4+ đƣợc sinh ra thấp nhất ở dịng vi khuẩn R6 với lƣợng NH4+ tạo ra là 0,474μg/ml.
Ngày thứ 6 lƣợng NH4+ tiếp tục đƣợc sinh ra và vƣợt trội nhất là dịng R4 với lƣợng NH4+ tạo ra là 0,823μg/ml, khác biệt cĩ ý nghĩa với các dịng vi khuẩn cịn lại. Tuy nhiên, dịng R3 cĩ lƣợng NH4+ tạo ra tăng nhƣng khơng nhiều bằng ngày 4 với lƣợng NH4+ tạo ra là 0,665μg/ml và dịng R5 cĩ lƣợng NH4+ sinh ra là 0,638μg/ml. Hai dịng R3 và R5 là 2 dịng vi khuẩn cĩ lƣợng NH4+ thấp nhất trong 6 dịng vi khuẩn.