- Crystal violet, iod - Fushin, ethanol 70% - Nƣớc cất f. Hĩa chất trích DNA - Ethanol 70% - Eppendorf 1,5ml và 2,0 ml - Micropipet
g. Hĩa chất thực hiện phản ứng PCR - Hĩa chất 2 lần đã khử trùng. - Hĩa chất 2 lần đã khử trùng. - Eppendorf 0.2ml - PCR buffer - dNTPs ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP) - Taq polymerase - DNA vi khuẩn
- Để nhận diện vi khuẩn nội sinh sống trong cây, sử dụng các đoạn mồi 16s rRNA (Lane,1991) đƣợc thiết kế với trình tự sau:
27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng). (Bảng 7) Bảng 7: Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Thể tích (μl) Nƣớc cất hai lần 11,75 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 Mồi xuơi 27F 0,25 Mồi ngƣợc 1492R 0,25 dNTPs 4,0
Taq polymerase (5U/μl) 0,25
DMSO ADN vi khuẩn
0,5 2,0
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh
a. Thu mẫu
Các mẫu Diếp Cá đƣợc thu từ các vùng đất ở Thành Phố Cần Thơ.
Dùng dao đào đất xung quanh cây Diếp Cá để cĩ thể thu đƣợc tồn bộ cây Diếp Cá. Sau đĩ cho vào bọc nylon và mang về phịng thí nghiệm Vi Sinh Vật để tiến hành xử lý mẫu và phân lập.
b. Xử lý mẫu và phân lập
Tách phần đất dính xung quanh rễ. Ngâm phần đất vừa tách vào nƣớc để sử dụng vào việc đo pH của đất vùng rễ, pH =7,2
Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá dƣới vịi nƣớc chảy
Tách rời rễ, thân và lá cây Diếp Cá (để ráo tự nhiên, để riêng từng bộ phận trong bọc nylon buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (5°C) nếu chƣa phân lập ngay).
Sau đĩ cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm rồi làm khơ chúng bằng giấy hút ẩm.
Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch ethanol 70% (trong 30 giây), dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 4 lần bằng nƣớc cất vơ trùng.
Lấy nƣớc rửa lần thứ 4 cấy trải lên mơi trƣờng PDA để xem cĩ vi khuẩn xuất hiện hay khơng. Nếu cĩ khuẩn lạc phát triển thì cần phải xử lý khử trùng triệt để hơn để loại bỏ vi sinh vật cĩ trong đất.
Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem giã nhuyễn trong cối, sau đĩ cho 1ml nƣớc cất vơ trùng vào mẫu và trộn đều.
Hút 200µl phần trong cho vào 800µl nƣớc cất đựng sẵn trong eppendorf (đã pha lỗng 5 lần ), đem vortex. Tiến hành pha lỗng mẫu 10 lần, 100 lần,… nếu cần thiết.
Hút 10µl dung dich mẫu đã pha lỗng cho vào ống nghiệm chứa mơi trƣờng NFb bán đặc, đậy nắp lại rồi đem ủ ở 30°C để vi khuẩn sinh trƣởng và phát triển.
từ vịng pellicle cấy trải sang đĩa petri chứa mơi trƣờng PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 30°C để vi khuẩn tiếp tục sinh trƣởng và phát triển.
Sau 2-3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, trịn và phải nằm trên đƣờng cấy tiến hành cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dƣới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã rịng.
Giã mẫu Rễ, Thân hoặc Lá
Cây Diếp Cá
Hút 10µl dung dịch cho vào mơi trƣờng NFB bán đặc
Sau 2 – 3 ngày
Vịng pellicle
Từ vịng pellicle cấy trải sang đĩaPDA
đặc
Phân lập đến rịng Hình 6: Quy trình phân lập vi khuẩn nội sinh trên Diếp Cá
3.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách rịng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phƣơng pháp giọt ép dƣới kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn nhƣ sau:
- Nhỏ 10μl nƣớc cất vơ trùng lên kính mang vật.
- Kim cấy đƣợc khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nƣớc trên kính mang vật.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nƣớc bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 gĩc 45° rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật khơng cĩ bọt khí.
Để đo kích thƣớc vi khuẩn ta dùng thƣớc trắc vi thị kính và thƣớc trắc vi vật kính nhƣ sau:
- Thƣớc trắc vi thị kính là một miếng kính trịn trên đĩ chia thành 100 vạch, nĩ đƣợc đặt giữa hai thấu kính của thị kính.
- Thƣớc trắc vi vật kính đƣợc đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm đƣợc chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng cĩ độ dài 10μm.
Phƣơng pháp đo kích thƣớc vi khuẩn nhƣ sau:
- Đặt thƣớc trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ ảnh của thƣớc.
- Xê dịch thƣớc trắc vi vật kính và xoay thƣớc trắc vi thị kính sao cho hai thƣớc song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thƣớc trắc vi vật kính sao cho một vạch của thƣớc trắc vi vật kính trùng với một vạch của thƣớc trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thƣớc trắc vi vật kính trùng với thƣớc trắc vi thị kính. - Đếm số khoảng cách của thƣớc trắc vi thị kính trùng với thƣớc trắc vi vật kính.
Trị số một khoảng của thƣớc trắc vi thị kính đƣợc tính theo cơng thức sau: m n N x 10 x: Trị số 1 khoảng cách của thƣớc trắc vi thị kính N: Số khoảng cách của thƣớc trắc vi vật kính, N = 6 n: Số khoảng cách của thƣớc trắc vi thị kính, n = 35 x 10m 35 6 Ta cĩ:
- Thay thƣớc trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu.
- Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thƣớc trắc vi thị kính, từ đĩ tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
- Đếm số khoảng cách thƣớc trắc vi nằm trong hai vạch này.
- Tính kích thƣớc vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của hai thƣớc nhân với trị số một khoảng của thƣớc trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh
Sau khi quan sát và đo kích thƣớc các tế bào vi khuẩn xong, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Lấy 10μl nƣớc cất vơ trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải ra cho đều và thật mỏng theo hình xoắn ốc.
- Hơ mặt dƣới của mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn cách khoảng 10cm nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Rửa bằng nƣớc cất vơ trùng từ 2 – 3 giây (để tránh trơi mẫu), chậm nhẹ cho khơ nƣớc.
- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch Iod để trong 1 phút. - Rửa lại bằng nƣớc cất vơ trùng, chậm nhẹ cho khơ.
- Rửa lại bằng cồn 70° thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng khơng cịn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nƣớc cất vơ trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khơ. - Nhỏ từ một đến hai giọt Fushin, để 1 phút.
- Rửa lại bằng nƣớc cất vơ trùng cho đến giọt nƣớc cuối cùng khơng cịn màu của Fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho khơ
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn cĩ màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dƣơng, cĩ màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm.
3.2.4 Xác định khả năng tổng hợp NH4+
a. Nguyên tắc
Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hĩa là hypochlorite hình thành cĩ phức màu xanh, dƣới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982).
b. Hĩa chất
- Chuẩn bị dung dịch KCl2 M: Hịa tan 15 g KCl vào trong 100 ml nƣớc cất.
- Stock (NH4+): Hịa tan 0,4717g (NH4)4SO4 vào 1 lít nƣớc. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trƣớc khi sử dụng pha lỗng 40ml stock (NH4+) để đƣợc 200ml, sau cùng đƣợc dung dịch 2µg/ml
- Thuốc thử phenol nitroprusside: hịa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong nƣớc đƣợc 0,5l.
c. Tiến hành thí nghiệm:
- Cho 15ml mơi trƣờng lỏng NFb, New và Burk vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ƣớt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuơi cấy các dịng vi khuẩn trên máy lắc 200 vịng/phút.
d. Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 và 8 (sau khi chủng)
- Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hịa tan thêm nƣớc cất vào đến 0,5l.
- Pha buffer: cho 1ml NaOCl cĩ nồng độ (5 – 5,25 %) và 5 g NaOH vào 0,5l nƣớc cất.
- Pha đƣờng chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm
+ Đƣờng chuẩn 0 ppm gồm cĩ: 5ml H2O, 0ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đƣờng chuẩn 1 ppm gồm cĩ: 4ml H2O, 1ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đƣờng chuẩn 2 ppm gồm cĩ: 3ml H2O, 2ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đƣờng chuẩn 3 ppm gồm cĩ: 2ml H2O, 3ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đƣờng chuẩn 4 ppm gồm cĩ: 1ml H2O, 4ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử + Đƣờng chuẩn 5 ppm gồm cĩ: 0ml H2O, 5ml NH4+, 5ml buffer, 5 ml thuốc thử
- Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
+ Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. + Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 10 phút.
+ Hút 1ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD.
+ Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bƣớc sĩng 636nm, sau đĩ vẽ đồ thị trên Excel cĩ thể tính đƣợc nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.
3.2.5 Xác định khả năng hịa tan lân
- Chuẩn bị mơi trƣờng NBRIP (Nautiyal, 1999). ( Bảng 1)
- Hút 5μl vi khuẩn nhỏ lên bề mặt mơi trƣờng.
- Ủ 30°C trong 12h – 24h.
- Quan sát khả năng tạo vịng halo. Đo đƣờng kính halo và khuẩn lạc mỗi ngày
- Hiệu quả hịa tan lân E đƣợc tính theo cơng thức 100 lạc khuẩn kính Đường halo kính Đường E (C. NGUYEN và ctv, 1992) 3.2.6 Xác định khả năng tổng hợp IAA a. Chuẩn bị
- Chuẩn bị các dịng vi khuẩn đã tách rịng và mơi trƣờng NFb lỏng.
- Cho 15ml mơi trƣờng lỏng NFb vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ƣớt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuơi cấy các dịng vi khuẩn trên máy lắc 200 vịng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dƣới ánh sáng)
b. Hĩa chất
- Thuốc thử: 4,5g FeCl3 trong 1 lít dd H2SO4 - Buffer
+ Dung dịch A2: 0,136g KH2SO4 trong 100ml nƣớc cất. + Dung dịch B2: 0,174g K2HSO4 trong 100ml nƣớc cất.
c. Phương pháp
- Lấy 39ml dung dịch A2, 61ml dung dịch B2 cho thêm nƣớc cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH = 7
- Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. - Ly tâm 5500 vịng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham.
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hồn tồn sau đĩ đo quang phổ OD ở bƣớc sĩng 530nm.
- Chuẩn bị đƣờng chuẩn IAA: Cân 0,0016g IAA thƣơng mại hịa tan với 10ml phosphat buffer đƣợc nồng độ là 160µg/l. Sau đĩ pha lỗng ra các nồng độ 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/ml.
- Kết quả đo phổ OD vẽ thành đƣờng chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD cĩ giá trị từ 0 – 3. Trục hồnh là nồng độ IAA cĩ giá trị từ 0 – 40µg/ml.
- Kết quả đo OD các dịng vi khuẩn phân lập đƣợc thay vào phƣơng trình đồ thị đƣờng chuẩn, từ đĩ tính đƣợc nồng độ IAA đã đƣợc vi khuẩn tổng hợp.
3.2.7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn
- Chuẩn bị mơi trƣờng LB ( Lauria Betani)
- Hút 50µl dung dịch pha lỗng của vi khuẩn gây bệnh (E. coli, A. hydrophila) trải lên bề mặt đĩa mơi trƣờng.
- Dùng giấy thấm đƣờng kính 6mm nhúng vào dung dịch vi khuẩn trong vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt mơi trƣờng đã trải vi khuẩn gây bệnh.
- Ủ 30°C trong 12h – 24h. Quan sát khả năng tạo vịng kháng khuẩn.
- Đo đƣờng kính khuẩn lạc (d) và đƣờng kính vịng (D) sáng 3 ngày liên tiếp. - Đƣờng kính vịng vơ khuẩn đƣợc tính bằng cơng thức:
Đƣờng kính vịng vơ khuẩn = D – d (Ngơ Thị Phƣơng Dung et al., 2011)
3.2.8 Nhận diện một số dịng vi khuẩn nội sinh trình vọng
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn đã phân lập đƣợc, chọn một số dịng vi khuẩn cĩ khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn cao để thực hiện phƣơng pháp PCR.
Quy trình trích ADN nhanh theo phƣơng pháp của Barberio và Fani (1998).
- Cấy vi khuẩn từ ống trữ rịng lên đĩa Petri chứa mơi trƣờng LB. Ủ 24h trong tủ ủ ở 30°C.
- Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf
Dung dich pha lỗng của
vi khuẩn gây bệnh Đĩa mơi trƣờng LB Hút 50µl trải
lên đĩa
Đặt giấy thấm đã nhúng vi khuẩn đƣợc phân lập từ cây Diếp Cá lên đĩa vừa trải Ủ 12 – 24h
Quan sát sự xuất hiện vịng vơ khuẩn
Hình 7: Quy trình thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn nội sinh trên Diếp Cá. (Hình vẽ, ngày 20-11-2013)
- Ly tâm nhẹ hai lần. Thu đƣợc dịch trích ADN của vi khuẩn. - Đem trữ ở -20°C nếu chƣa tiến hành quy trình PCR.
Nhận diện các dịng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
- Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng) (Bảng 7). Quy trình PCR
- Biến tính DNA ở 95°C trong 5 phút.
- Tiếp theo là 3 chu trình đƣợc gia nhiệt nhƣ sau: + 95°C trong 1 phút
+ 49°C trong 1 phút + 72°C trong 1 phút
- Bƣớc cuối cùng là 72°C trong 10 phút.
- Sản phẩm PCR sau đĩ đƣợc trữ lạnh ở -20°C để điện di - Điện di gel agarose sản phẩm PCR
- Sản phẩm DNA sau khi trích, đƣợc tiến hành khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sai đĩ kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% cĩ chứa ethidium bromide. Sản phẩm gel sau khi điện di đƣợc chụp bằng máy chụp hình gel Bio – Rad UV 2000 (Hoa Kỳ)
- Chuẩn bị gel nhỏ : (20ml) + Agarose (1%): 0,2g + TAE buffer (1X): 20ml
- Nấu 2 phút cho tan Agarose trong lị vi sĩng (microwave) - Sau khi nấu để nguội khoảng 50 – 60°C, bổ sung EtBr 0,4μl
- Rĩt gel vào khuơn. Sau khi rĩt gel vào khuơn khoảng 90 phút ta tiến hành load mẫu.
- Load mẫu: dùng Micropipet hút 10μl Loading Buffer (LB) chia làm 4 giọt trên giấy parafilm. Hút 10μl mẫu DNA vi khuẩn, trộn với giọt Loading Buffer trên và load mẫu vào giếng.
- Điện di 60 phút ở 90V. Chụp hình gel bằng máy chụp gel Bio – Rad.
Dùng phần mềm Microsoft Excel để nhập và xử lý số liệu và phần mềm Minitab để phân tích thống kê.
CHƢƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập vi khuẩn từ cây Diếp Cá.
4.1.1 Phân lập các dịng vi khuẩn.
Sau khi hút chuyển 10μl dịch trích vào ống nghiệm chứa mơi trƣờng NFb bán đặc, và đƣợc ủ từ 2 đến 3 ngày, các dịng vi khuẩn phân lập từ rễ, thân và lá của cây Diếp Cá đều sinh trƣởng và phát triển tốt trong điều kiện vi hiếu khí. Sự phát triển này tạo thành 1