2. Mục đích nghiên cứu
2.4. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
- Địa điểm: Viện di truyền Nông Nghiệp, Bộ môn Kỹ thuật Di truyền.
Khóa luận tốt nghiệp 32
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả
3.1.1.Tách chiết và tinh sạch ADN
Tách chiết ADN là bƣớc đầu tiên khá quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phƣơng pháp tách chiết ADN bằng CTAB. Lá non 3 tuần sau khi cấy của những giống nghiên cứu đƣợc thu để tách chiết ADN. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng với ADN chuẩn. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực tím. Kết quả tách chiết ADN đƣợc minh hoạ ở hình 3.1.
Hình 3.1.Một số hỉnh ảnh kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phƣơng pháp CTAB trên gel agarose 0,8%.
Giếng số 1- Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng/l), giếng số 3 – Khang dân, , giếng số 6 – KC25.
Khóa luận tốt nghiệp 33
Kết quả tách chiết ADN cho thấy phƣơng pháp tách chiết ADN bằng CTAB cho hiệu quả cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch. Các mẫu ADN không bị đứt gãy, việc loại bỏ ARN bằng RNase tiến hành khá tốt thể hiện các băng điện di gọn, rõ. Những mẫu ADN này đủ điều kiện để sử dụng cho những thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.
3.1.2. Khảo sát tính đa hình ADN QTL/gen quy đinh tính trạng tăng số hạt trên bông.
Đa hình giữa hai giống lúa có thể đƣợc phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại đƣợc khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình ADN giữa các giống cho gen và nhận gen với các chỉ thị SSR trên 12 NST nhằm phục vụ chọn lọc nền di truyền giống nhận gen và chọn lọc các cá thể con lai.
Dòng (KC25) có mang QTL quy định tính trạng tăng số hạt trên bông
Yd7. Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng xác định nền di truyền trong các cá thể con lai, tiến hành phản ứng PCR với ADN của các giống lúa: 1.Khang dân; 2.KC25 bằng sử dụng chỉ thị 60/156. Một vài kết quả chạy đa hình đƣợc thể hiện qua các hình 3.2, hình 3.3, hình 3.4.
Khóa luận tốt nghiệp 34
Hình 3.2. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM2108; RM10916; RM24865
Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.
Quan sát Hình 3.2 ta thấy các chỉ thị RM1208, RM10916, đƣờng chạy số 3(mẫu ADN của giống KC25) xuất hiện băng ADN cao hơn các băng ở đƣờng chạy số 4 (mẫu ADN của giống Khang dân).Chỉ thị RM24865 ở đƣờng chạy số 3 xuất hiện băng ADN thấp hơn băng ADN ở đƣờng chạy số 4. Sự chênh lệch về vị trí các băng ADN ở các đƣờng chạy 4 với 3 thể hiện đa hình giữa giống Khang dân với giống KC25.
Hình 3.3. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM19199; RM19238; RM22825
Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.
L 3 4 L 3 4
Khóa luận tốt nghiệp 35
Kết quả Hình 3.3 cũng cho thấy chỉ thị RM19199, RM22825 có vị trí mẫu ADN ở đƣờng chạy số 3 cao hơn đƣờng chạy số 4. Ở chỉ thị RM19238 mẫu ADN ở đƣờng chạy số 4 lên mờ, đƣờng chạy số 3. Chỉ thị RM21471 ở tất cả các giếng không xuất hiện băng vạch nào có thể do mồi không hoạt động hoặc do làm phản ứng sai.
Hình 3.4. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM6; RM3; RM345
Ladder; 3. KC25; 4. Khang dân.
Chỉ thị RM6, RM3, RM345 mẫu ADN ở đƣờng chạy số 3 có vị trí thấp hơn các đƣờng chạy số 2,4,5 do vậy chỉ thị RM6, RM3, RM345 cho đa hình giữa các giống Khang dân và KC25.
Khóa luận tốt nghiệp 36
Hình 3.5. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM22897; RM11504; RM19840; RM20019; RM21539; RM 22870
Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.
Hình 3.6. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM11757; RM13155; RM18161; RM19545; RM20848
Khóa luận tốt nghiệp 37
Hình 3.7. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM21584; RM21645; RM22786; RM24865; RM25022
Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.
Hình 3.8. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM11745; RM11799; RM11874; RM20163; RM20193
Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.
Hình 3.9. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM19199; RM19238; RM21417; RM22825; RM23654; RM25181; RM25271; RM23060
Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.
RM11438 RM12769 RM13197 RM13332 RM14795 RM14820 3 3 3 3 3 3
Khóa luận tốt nghiệp 38
Hình 3.10. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM16589; RM16820; RM17391; RM17411; RM19034
Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.
Hình 3.11. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM6; RM3; RM345
Khóa luận tốt nghiệp 39
Sau khi phân tích các kết quả chạy điện di kiểm tra chúng tôi xác định đƣợc 62/156 chỉ thị cho đa hình giữa Khang dân với (KC25). Kết quả tổng hợp đƣợc thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống Khang dân và KC25
Ch.r Tên chỉ thị phân tử cho đa hình Số lƣợng
1 RM10115, RM10136, RM10694, RM10741, RM10800, RM10815, RM10916, RM11062, RM11438, RM11504, RM1287, RM3412b, RM493, RM5365, RM7075. 15 2 RM526, RM5356, RM6, RM7355. 4 3 RM14795, RM14820, RM282, RM3297, RM3654, RM5480, RM7389. 7 4 RM16589, RM16820, RM280, RM3333, RM349, RM551. 6 5 RM19199; RM31, RM7027. 3 6 RM3, RM345, RM494, RM527, RM528, RM7434. 6 7 RM11, RM21539, RM21769, RM248, RM7338. 5 8 RM22825, RM331, RM447. 3 9 RM296, RM11874, RM1208. 3
Khóa luận tốt nghiệp 40 10 RM24865, RM25181, RM25271, RM3628. 4 11 RM7283, RM19840, RM341. 3 12 RM1194, RM247, RM7102. 3 Tổng 62 3.2. Thảo luận
Nhƣ đã đề cập ở trên, ứng dụng chỉ thị phân tử có thể coi là một trong những bƣớc đột phá trong nghiên cứu chọn tạo giống. Nhờ có ứng dụng này, có thể chuyển đƣợc những QTL/gen quan tâm vào các giống lúa trồng đại trà mà vẫn giữ nguyên đƣợc tính trạng giống gốc. Cùng với nghiên cứu nhân bản và phân tích chức năng của các QTL/gen, đã giúp hiểu biết sâu hơn về cơ chế phân tử và di truyền dựa trên các tính trạng năng suất. Các QTL/gen này đã mở ra triển vọng và tạo thuận lợi giúp các nhà nghiên cứu chọn tạo đƣợc những giống lúa có năng suất tiềm năng. Quy tụ các gen quan tâm đã và sẽ là một chiến lƣợc hiệu quả trong cải tiến di truyền học ở lúa. Chẳng hạn nhƣ kết hợp Gn1 (Gn1a +Gn1b) và sd1 vào giống lúa Koshihikari đã đồng thời cải tiến hai tính trạng đã tăng đƣợc số hạt trên bông trên 25% và giảm chiều cao thân xuống 18% so với giống đối chứng. Dòng NIL (GW8/gs3) với việc quy tụ GW8 và gs3 cho hạt dài và dày hơn đối với dòng NIL hoang dại.
Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu về tính trạng tăng năng suất lúa, nhƣng vẫn còn nhiều thách thức cần phải chứng minh về cơ chế phân tử quy định tính hình thành các tính trạng năng suất. Hầu hết tất cả các tính trạng năng suất bao gồm số bông trên khóm, số hạt trên bông, và khối lƣợng hạt biểu hiện nhiều biến dị liên tục trong quần thể di truyền hoặc ngay giữa
Khóa luận tốt nghiệp 41
các giống đã đƣợc thƣơng mại, là tính trạng đó do nhiều gen hay QTL quy định. Cơ sở dữ liệu Gramene, đã lƣu trữ và xác định hàng ngàn QTL/gen liên quan đến tính trạng năng suất từ nghiên cứu lập bản đồ chi tiết và đa số các QTL này có hiệu ứng di truyền nhỏ, gây nhiều khó khăn xác định thông qua phân tích đột biến.
Khóa luận tốt nghiệp 42
CHƢƠNG IV
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Đã xác định đƣợc 62/156 chỉ thị cho đa hình giữa giống Khang Dân và KC25 nằm trải đều trên 12 NST.
4.2. Kiến nghị
1/ Sử dụng 62 chỉ thị đa hình giữa giống Khang dân và (KC25) cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm sàng lọc nền di truyền của các cá thể con lai.
2/ phát triển quần thể BC1F1, BC2F2..., các cá thể mang gen sẽ đƣợc đánh giá nền di truyền giống công nhận gen nhất.
Khóa luận tốt nghiệp 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nƣớc:
1. Nguyễn Ngọc Đệ (2008). Giáo trình cây lúa, Trƣờng Đại Học Cần Thơ. 2. Nguyễn Duy Bảy, Bùi Chí Cửu, Bùi Bá Bổng (2001), “Genetic markers in genome research and plant breeding”, Chọn giống nhờ Marker và Phân tích QTL, Viện lúa Đồng Bằng sông Cửu Long, tr.44-58
3. Lã Hoàng Anh, 2013, Nghiên cứu chọn tạo giống lúa Khang dân chịu ngập bằng phƣơng pháp chỉ thi phân tử (Marker Assiste BackCrosing), Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Hà Nội.
4. Lê Đình Lƣơng, Phan Cự Nhân (1997), Cơ sở di truyền học, NXB Giáo Dục
5. Phạm Chí Thành (1986), Phương Pháp thí nghiệm đồng ruộng. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội.
6. Võ Thị Hƣơng Lan (2006). Giáo trình Sinh học Phân tử tế bào, NXB Giáo dục.
Tài liệu nƣớc ngoài:
7.Septingsih EM, Pamplona AM, Sanchez DL, Maghirang – Rodriguez R Neeraja CN, Vergara GV, Heuer S, Ismail AM, Mackill DJ (2009),
Development of submergence – tolerant rice cultivars: The sub1 gene and beyond, Ann.Bot.
8. Thomson MJ, Tai TH, McClung AM, Lai XH, Hinga ME, Lobos KB, Xu Y, Martinez CP and McCouch SR (2003) Mapping quantitative trait loci for yield components and morphological traits in an advanced backcross population between Oryza rufipogon and the Oryza sativa cultivar Jefferson. Theor Appl. Genet.
9. Zhuang JY, Lin HX, Lu J, Qian HR, Hittalmani S, Huang N and Zheng KL (1997) Analysis of QTL x environment interaction for yield components and plant height in rice. Theor Appl Genet.
Khóa luận tốt nghiệp 44
10. Zhuang JY, Fan YY, Rao ZM, Wu JL, Xia YW and Zheng KL (2002) Analysis on additive effects and additive-by-additive epistatic effects of QTLs for yield traits in a recombinant inbred line population of rice. Theor Appl Genet.
11. Xiao J, Li J, Yuan L, Tanksley SD (1996) Identification of QTLs affecting traits of agronomic importance in a recombinant inbred population derived from a subspecific rice cross. Theor Appl Genet.
12. 1. Lu Y.D. (1995), The Wild Relatives of Oryza: Nomenclature and Potention value in Rice Improvement, In: Field Collection and Conservation Genetic Resources Center, IRRI, Los Banos, the Philippines.
Wedsite: 13. http://ias-cnsh.org/tabid/65/BlogID/14/Default.aspx. 14.http://nongthonmoihatinh.vn/vi/news/Khoa-hoc-cong-nghe/Nhung-giong- lua-moi-2014-21989/. 15.http://ias- cnsh.org/CNSHTh%E1%BB%B1cV%E1%BA%ADt/CNSHTrongS%E1%B A%A3nXu%E1%BA%A5tTh%E1%BB%B1cPh%E1%BA%A9mS%E1%B A%A1ch/tabid/65/BlogId/14/BlogDate/2012-09- 30/DateType/month/Default.aspx. 16. http://trungtamnghiencuuthucpham.vn/phat-hie%CC%A3n-mot-loai-gene- lua-moi-cho-nang-suat-cao/. 17.http://www.zbook.vn/ebook/tim-hieu-dac-diem-nong-sinh-hoc-va-nang- suat-cua-mot-so-giong-lua-moi-tai-vinh-phuc-46653/. 18.http://lamdongdost.gov.vn/sokhcn/LinkClick.aspx?fileticket=RcgxXDNF7 L8%3D&tabid=113.