Phƣơng pháp nghiên cứu

2. Mục đích nghiên cứu

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số

ADN lúa đƣợc tách chiết và tinh sạch theo phƣơng pháp CTAB cải tiếntrên cơ sở phƣơng pháp của Shagai – Maroof (của phòng thí nghiệm Di truyền học, Trƣờng đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ, năm 1984).

Quy trình thực hiện gồm các bƣớc:

- Lá của các giống lúa nghiên cứu đƣợc cắt lấy mẫu sau khi cấy 2 - 3 tuần. Mẫu đƣợc lấy vào sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá thấp, các enzym hoạt động ít là điều kiện tốt để tách chiết ADN.

- Nghiền mẫu cùng với nitơ lỏng trong eppendorf (hoặc cối) thành dạng bột mịn, khi nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng.

- Cho mẫu vào eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết (100mM Tris HCl, pH 8): 500mM NaCl: 50mM EDTA, pH 8,0): 0,07%  - Mercaptol ethanol) rồi đảo đều, giữ trong đá và thêm 50l SDS 10%.

Khóa luận tốt nghiệp 26

- Đặt vào nồi cách thủy ủ trong 30 phút ở 650C, thỉnh thoảng đảo cho dịch đƣợc trộn đều.

- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 20 phút.

- Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Thêm 1ml isopropanol alcohol rồi để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc qua đêm) không để vào tủ lạnh sâu -200

C vì sẽ gây hiện tƣợng kết tủa muối. - Ly tâm 13500 vòng/phút trong 25 phút.

- Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại tủa ở dƣới đáy eppendorf. Cho 400l đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0) cho vào tủ 650

C ủ trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hoà tan tủa, bƣớc này có thể giữ ở 40C qua đêm.

- Cho 3l Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC khoảng 3 tiếng.

- Thêm 400l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650

C trong 15 phút, thỉnh thoảng trộn, lắc đều.

- Cho và tủ hút, thêm vào 800l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc trộn từ 5 – 7 phút nhằm loại bỏ protein.

- Ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch bên trong eppendorf tách thành 2 phần. Sử dụng pipet hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Nếu chƣa sạch có thể chiết lại lần 2 bằng chloroform/isoamyl alcohol (24:1).

- Thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong tủ lạnh sâu (-200C). - Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa trắng ở đáy ống.

- Rửa tiếp bằng 400l cồn 70% rồi đƣa vào máy ly tâm 13500 vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm

Khóa luận tốt nghiệp 27

khô chân không khoảng 10 phút làm khô tủa (ADN), sau đó cho 100l TE (10: 1) vào mỗi eppendorf hoà tan tủa.

- Giữ ADN trong tủ lạnh sâu (- 200C) để sử dụng cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo.

2.3.2. Phương pháp PCR với mồi thí nghiệm

Các thành phần tham gia phản ứng PCR đƣợc chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lƣợng của các chất trong mỗi phản ứng nhƣ trong bảng 2.3.1. Bảng 2.3.1. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (l) 1 H2O cất khử trùng 8.95 2 Buffer 10X 1,5 3 MgCl2 (50mM) 0,45 4 dNTP (1mM) 1,0

5 Taq DNA polymeraza (5U) 0,1

6 Primer forward 5M 0,5

7 Primer Revert 5M 0,5

8 ADN (35ng/ l) 2,0

Khóa luận tốt nghiệp 28

Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lƣợng các chất cần thiết, tiến hành đặt chƣơng trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR nhƣ sau:

Bảng 2.3.2. Chƣơng trình chạy của phản ứng PCR Bƣớc Nhiệt độ (o

C) Thời gian Số chu kỳ

1 94 5 phút 1 2 94 30 giây 35 55* 30 giây 72 45 giây 3 72 5 phút 1 4 10 8 1

(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi thí nghiệm

2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

Các bƣớc tiến hành

- Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác

- Đun trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất. - Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều.

- Chuẩn bị khay và lƣợc. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông.

- Rút lƣợc, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm.

- Tra sản phẩm PCR đã đƣợc trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ 5l Xylen cyanol /15l mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng để điện di dài hay

Khóa luận tốt nghiệp 29

ngắn phụ thuộc vào kích thƣớc của cặp mồi thí nghiệm cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp.

- Soi gel trên máy soi cực tím.

2.3.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính

+ Chuẩn bị kính

- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nƣớc cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.

- Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch.

Chú ý: Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn.

- Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) đƣợc tạo thành bằng cách thêm 2l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid.

- Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.

- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm. Chuẩn bị gel polyacrylamide

- Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha trong 1 lít nƣớc) - Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’- Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.

- Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí. - Cài lƣợc vào giữa hai tấm kính (răng lƣợc hƣớng ra phía ngoài). Dùng kẹp cố định lƣợc.

Khóa luận tốt nghiệp 30

+ Điện di

- Tháo lƣợc và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. - Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dƣới.

- Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khuôn gel.

- Chạy tiền điện di (prerun) với cƣờng độ dòng điện là 50 - 60A, công suất 92 - 100W.

- Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút.

Sản phẩm PCR lúc này đã đƣợc trộn với 4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol).

- Tra vào mỗi giếng 5l sản phẩm PCR đã đƣợc làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 50 bp.

Thời gian tra mẫu không kéo dài quá dài để gel không bị nguội đi nhiều. - Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thƣớc từng mồi sử dụng.

+ Phƣơng pháp nhuộm bạc Chuẩn bị các dung dịch

- Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid và 900ml nƣớc cất.

- Dung dịch nhuộm (Staining solution) đƣợc tạo thành bằng cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nƣớc cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37%.

- Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nƣớc cất và làm lạnh ở -200

Khóa luận tốt nghiệp 31

Chú ý: (Trƣớc khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% và 200l natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).

Tiến hành nhuộm

Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bƣớc sau:

- Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hƣớng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý. Giữ lại dung dịch này để dùng cho bƣớc sau. - Rửa gel bằng nƣớc cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nƣớc cất trong 5 - 10 giây.

- Đƣa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nƣớc cất. Để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.

2.4. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm: Viện di truyền Nông Nghiệp, Bộ môn Kỹ thuật Di truyền.

Khóa luận tốt nghiệp 32

CHƢƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả

3.1.1.Tách chiết và tinh sạch ADN

Tách chiết ADN là bƣớc đầu tiên khá quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phƣơng pháp tách chiết ADN bằng CTAB. Lá non 3 tuần sau khi cấy của những giống nghiên cứu đƣợc thu để tách chiết ADN. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng với ADN chuẩn. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực tím. Kết quả tách chiết ADN đƣợc minh hoạ ở hình 3.1.

Hình 3.1.Một số hỉnh ảnh kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phƣơng pháp CTAB trên gel agarose 0,8%.

Giếng số 1- Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng/l), giếng số 3 – Khang dân, , giếng số 6 – KC25.

Khóa luận tốt nghiệp 33

Kết quả tách chiết ADN cho thấy phƣơng pháp tách chiết ADN bằng CTAB cho hiệu quả cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch. Các mẫu ADN không bị đứt gãy, việc loại bỏ ARN bằng RNase tiến hành khá tốt thể hiện các băng điện di gọn, rõ. Những mẫu ADN này đủ điều kiện để sử dụng cho những thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.

3.1.2. Khảo sát tính đa hình ADN QTL/gen quy đinh tính trạng tăng số hạt trên bông.

Đa hình giữa hai giống lúa có thể đƣợc phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại đƣợc khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình ADN giữa các giống cho gen và nhận gen với các chỉ thị SSR trên 12 NST nhằm phục vụ chọn lọc nền di truyền giống nhận gen và chọn lọc các cá thể con lai.

Dòng (KC25) có mang QTL quy định tính trạng tăng số hạt trên bông

Yd7. Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng xác định nền di truyền trong các cá thể con lai, tiến hành phản ứng PCR với ADN của các giống lúa: 1.Khang dân; 2.KC25 bằng sử dụng chỉ thị 60/156. Một vài kết quả chạy đa hình đƣợc thể hiện qua các hình 3.2, hình 3.3, hình 3.4.

Khóa luận tốt nghiệp 34

Hình 3.2. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM2108; RM10916; RM24865

Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.

Quan sát Hình 3.2 ta thấy các chỉ thị RM1208, RM10916, đƣờng chạy số 3(mẫu ADN của giống KC25) xuất hiện băng ADN cao hơn các băng ở đƣờng chạy số 4 (mẫu ADN của giống Khang dân).Chỉ thị RM24865 ở đƣờng chạy số 3 xuất hiện băng ADN thấp hơn băng ADN ở đƣờng chạy số 4. Sự chênh lệch về vị trí các băng ADN ở các đƣờng chạy 4 với 3 thể hiện đa hình giữa giống Khang dân với giống KC25.

Hình 3.3. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM19199; RM19238; RM22825

Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.

L 3 4 L 3 4

Khóa luận tốt nghiệp 35

Kết quả Hình 3.3 cũng cho thấy chỉ thị RM19199, RM22825 có vị trí mẫu ADN ở đƣờng chạy số 3 cao hơn đƣờng chạy số 4. Ở chỉ thị RM19238 mẫu ADN ở đƣờng chạy số 4 lên mờ, đƣờng chạy số 3. Chỉ thị RM21471 ở tất cả các giếng không xuất hiện băng vạch nào có thể do mồi không hoạt động hoặc do làm phản ứng sai.

Hình 3.4. Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM6; RM3; RM345

Ladder; 3. KC25; 4. Khang dân.

Chỉ thị RM6, RM3, RM345 mẫu ADN ở đƣờng chạy số 3 có vị trí thấp hơn các đƣờng chạy số 2,4,5 do vậy chỉ thị RM6, RM3, RM345 cho đa hình giữa các giống Khang dân và KC25.

Khóa luận tốt nghiệp 36

Hình 3.5. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM22897; RM11504; RM19840; RM20019; RM21539; RM 22870

Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.

Hình 3.6. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM11757; RM13155; RM18161; RM19545; RM20848

Khóa luận tốt nghiệp 37

Hình 3.7. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM21584; RM21645; RM22786; RM24865; RM25022

Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.

Hình 3.8. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM11745; RM11799; RM11874; RM20163; RM20193

Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.

Hình 3.9. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM19199; RM19238; RM21417; RM22825; RM23654; RM25181; RM25271; RM23060

Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.

RM11438 RM12769 RM13197 RM13332 RM14795 RM14820 3 3 3 3 3 3

Khóa luận tốt nghiệp 38

Hình 3.10. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM16589; RM16820; RM17391; RM17411; RM19034

Ladder; 3.KC25; 4. Khang dân.

Hình 3.11. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM6; RM3; RM345

Khóa luận tốt nghiệp 39

Sau khi phân tích các kết quả chạy điện di kiểm tra chúng tôi xác định đƣợc 62/156 chỉ thị cho đa hình giữa Khang dân với (KC25). Kết quả tổng hợp đƣợc thể hiện ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Các chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống Khang dân và KC25

Ch.r Tên chỉ thị phân tử cho đa hình Số lƣợng

1 RM10115, RM10136, RM10694, RM10741, RM10800, RM10815, RM10916, RM11062, RM11438, RM11504, RM1287, RM3412b, RM493, RM5365, RM7075. 15 2 RM526, RM5356, RM6, RM7355. 4 3 RM14795, RM14820, RM282, RM3297, RM3654, RM5480, RM7389. 7 4 RM16589, RM16820, RM280, RM3333, RM349, RM551. 6 5 RM19199; RM31, RM7027. 3 6 RM3, RM345, RM494, RM527, RM528, RM7434. 6 7 RM11, RM21539, RM21769, RM248, RM7338. 5 8 RM22825, RM331, RM447. 3 9 RM296, RM11874, RM1208. 3

Khóa luận tốt nghiệp 40 10 RM24865, RM25181, RM25271, RM3628. 4 11 RM7283, RM19840, RM341. 3 12 RM1194, RM247, RM7102. 3 Tổng 62 3.2. Thảo luận

Nhƣ đã đề cập ở trên, ứng dụng chỉ thị phân tử có thể coi là một trong những bƣớc đột phá trong nghiên cứu chọn tạo giống. Nhờ có ứng dụng này, có thể chuyển đƣợc những QTL/gen quan tâm vào các giống lúa trồng đại trà mà vẫn giữ nguyên đƣợc tính trạng giống gốc. Cùng với nghiên cứu nhân bản và phân tích chức năng của các QTL/gen, đã giúp hiểu biết sâu hơn về cơ chế phân tử và di truyền dựa trên các tính trạng năng suất. Các QTL/gen này đã mở ra triển vọng và tạo thuận lợi giúp các nhà nghiên cứu chọn tạo đƣợc những giống lúa có năng suất tiềm năng. Quy tụ các gen quan tâm đã và sẽ là một chiến lƣợc hiệu quả trong cải tiến di truyền học ở lúa. Chẳng hạn nhƣ kết hợp Gn1 (Gn1a +Gn1b) và sd1 vào giống lúa Koshihikari đã đồng thời cải tiến hai tính trạng đã tăng đƣợc số hạt trên bông trên 25% và giảm chiều cao thân xuống 18% so với giống đối chứng. Dòng NIL (GW8/gs3) với việc quy tụ GW8 và gs3 cho hạt dài và dày hơn đối với dòng NIL hoang dại.

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu về tính trạng tăng năng suất lúa, nhƣng vẫn còn nhiều thách thức cần phải chứng minh về cơ chế phân tử quy định tính hình thành các tính trạng năng suất. Hầu hết tất cả các tính trạng năng suất bao gồm số bông trên khóm, số hạt trên bông, và khối lƣợng