Lactobacillus
4.1.1 Phân lập vi khuẩn từ dạ dày và ruột cá tra và cá trê
Mười bảy (17) dòng vi khuẩn đã được phân lập tách ròng trên môi trường MRS agar từ dạ dày và ruột cá tra và cá trê thu được từ 3 mô hình nuôi (quản canh, bán thâm canh, thâm canh) và tại các chợ và hộ gia đình khác nhau thuộc 2 tỉnh Đồng Tháp và Vĩnh Long (Bảng 7).
Bảng 6. Các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc từ cá tra và cá trê ở 2 tỉnh Đồng Tháp và Vĩnh Long
Stt Dòng lập từ Phân
Mô hình nuôi
Địa điểm thu
mẩu Nuôi bằng thức ăn
Quản canh Bán thâm canh Thâm canh Thu tại chợ
1 CT1-TB1 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
2 CT1-TB2 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
3 CT1-TB3 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
4 CT1-TB6 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
5 CT1-TB9 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
6 CT2-TB4 Cá trê + Tam Bình Tạp
7 CT2-TB7 Cá trê + Tam bình Tạp
8 CT2-TB11 Cá trê + Tam Bình Tạp
9 CT2-TB14 Cá trê + Tam Bình Tạp
10 CT2-TB18 Cá trê + Tam Bình Tạp
11 CT3-TB8 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
12 CTR1-LV1 Cá tra + Lấp Vò Công nghiệp
13 CTR1-LV3 Cá tra + Lấp Vò Công nghiệp
14 CTR1-LV4 Cá tra + Lấp Vò Công nghiệp
15 CTR1-LV6 Cá tra + Lấp Vò Bổ sung probiotic
16 CTR1-LV8 Cá tra + Lấp Vò Bổ sung probiotic
17 CTR1-LV9 Cá tra + Lấp Vò Bổ sung probiotic
Ghi chú: (+) mô hình nuôi mà cá được thu mẫu.Tên dòng vi khuẩn được đặt tên theo nguyên tắc: Loài cá phân lập + địa điểm thu mẫu, CT là cá trê, CTR là cá tra, TB là mẫu được thu ở Tam Bình, LV là mẫu được thu ở Lấp Vò.
Trong tổng số 17 dòng vi khuẩn phân lập được có 6 dòng được phân lập từ cá tra (chiếm 35,3 %), 11 dòng được phân lập từ cá trê (chiếm 64,7 %).
Trong số 6 dòng vi khuẩn phân lập từ cá tra: 3 dòng (chiếm 50%) được phân lập từ mô hình nuôi thâm canh chỉ cho cá ăn thức ăn thức ăn công nghiệp mà không bổ sung
chế phẩm probiotic. 3 dòng (chiếm 50 %) được phân lập từ mô hình nuôi bán thâm canh cho cá ăn thức ăn công nghiệp có bổ sung chế phẩm probiotic.
Có 11 dòng vi khuẩn được phân lập từ cá trê. Trong đó có 3 (chiếm 27,3 %) dòng được phân lập từ cá trê nuôi theo mô hình quản canh và 2 dòng (chiếm 18,2 %) phân lập từ cá trê mua ở chợ được cho ăn bằng thức ăn tạp. 6 dòng (chiếm 54,5 %) nuôi theo mô hình bán thâm canh cho cá ăn bằng thức ăn công nghiệp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc a. Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập
Trên môi trường MRS agar, khuẩn lạc của 17 dòng vi khuẩn phân lập sau 48 giờ nuôi cấy tất cả có màu trắng đục (17 dòng chiếm 100 %), tất cả các dòng vi khuẩn đều có khuẩn lạc tròn, bóng, bìa nguyên, lài hoặc nhô cao, kích thước từ 0.5 - 4mm (Hình 4.1, Bảng 8). Trong đó có 1 dòng khuẩn lạc có đường kính 0,5 mm (chiếm 5,9%), 2 dòng khuẩn lạc có đường kính 1 mm (chiếm 11,8 %), 4 dòng khuẩn lạc có đường kính 1,5 mm (chiếm 23,5%), 6 dòng khuẩn lạc có đường kính 2 mm (chiếm 35,3%), 1 dòng khuẩn lạc có đường kính 2,5 mm (chiếm 5,9%), 1 dòng khuẩn lạc có đường kính 3 mm (chiếm 5,9% ) và 2 dòng khuẩn lạc có đường kính 4 mm (chiếm 11, 8%). Trong 17 dòng vi khuẩn trên, có 16 dòng có khuẩn lạc nhô cao (chiếm 94,1%), 1 dòng có khuẩn lạc lài (chiếm 5,9%).
Hình 3. Khuẩn lạc các dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập trên môi trƣờng MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy
a b
Bảng 7. Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên môi trƣờng MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy
Stt Dòng Hình dạng khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc Kích thƣớc (mm)
1 CT1-TB1 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 4 2 CT1-TB2 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 3 3 CT1-TB3 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 1,5 4 CT1-TB6 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 4 5 CT1-TB9 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 2 6 CT2-TB4 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 1,5 7 CT2-TB7 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 0,5 8 CT2-TB11 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 1,5 9 CT2-TB14 Tròn, bìa nguyên, lài Trắng đục 2 10 CT2-TB18 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 1 11 CT3-TB8 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 2 12 CTR1-LV1 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 1 13 CTR1-LV3 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 1,5 14 CTR1-LV4 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 2 15 CTR1-LV6 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 2 16 CTR1-LV8 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 2 17 CTR1-LV9 Tròn, bìa nguyên, nhô cao Trắng đục 2,5
- Đặc điểm tế bào vi khuẩn:
Hình 4. Hình thái các dòng vi khuẩn phân lập ở độ phóng đại 1000 lần của dòng CT2-TB7 có hình que ngắn
Bảng 8 . Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy
Stt Dòng Chuyển động Hình dạng vi khuẩn 1 CT1-TB1 - Que dài 2 CT1-TB2 - Que ngắn 3 CT1-TB3 - Que dài 4 CT1-TB6 - Que ngắn 5 CT1-TB9 - Que ngắn 6 CT2-TB4 - Que dài 7 CT2-TB7 - Que ngắn 8 CT2-TB11 - Que ngắn 9 CT2-TB14 - Que dài 10 CT2-TB18 - Que ngắn 11 CT3-TB8 - Que ngắn 12 CTR1-LV1 - Que dài 13 CTR1-LV3 - Que ngắn 14 CTR1-LV4 - Que ngắn 15 CTR1-LV6 - Que dài 16 CTR1-LV8 - Que ngắn 17 CTR1-LV9 - Que dài
Ghi chú: (+) chuyển động, (-) không chuyển động
b. Đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập
Kết quả nhuộm Gram cho thấy tế bào của tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều bắt màu tím xanh của thuốc nhuộm Crystal Violet chứ không phải bắt màu đỏ của Fushin. Qua đó cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập được đều là vi khuẩn Gram dương (hình 5).
Hình 5. Vi khuẩn phân lập Gram dƣơng sau khi nhuộm ở độ phóng đại 1000 lần của dòng vi khuẩn phân lập CT1-TB3
Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường MRS agar sau 48 giờ cấy sẽ được chọn kiểm tra sự hiện diện của enzyme catalase và cytochrome oxidase. Khi được thử với H2O2 3%, khuẩn lạc của tất cả các dòng đều không có hiện tượng sủi bọt khí, chứng tỏ các dòng đều không có hệ enzyme catalase để phân giải H2O2 3% thành nước và oxy hay nói cách khác là các dòng vi khuẩn phân lập có catalase âm tính (Hình 6).
Hình 6. Thử nghiệm catalase các dòng vi khuẩn phân lập
a. Dòng CT1-TB3 catalase âm tính b. Dòng (đối chứng) catalase dương tính Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều cho kết quả oxidase âm tính vì khi được kiểm tra với giấy lọc có tẩm thuốc thử Tetramethyl-p-phenylendiamin dihydrochlorid, khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn không làm đổi màu của giấy lọc từ màu trắng sang màu xanh. Trong khi dòng được sử dụng làm đối chứng làm giấy lọc đổi màu từ màu trắng sang màu xanh (Hình 7).
Hình 7. Thử nghiệm oxidase các dòng vi khuẩn phân lập
a. Dòng CT1-TB3 oxidase âm tính b. Dòng (đối chứng) oxidase dương tính Sau khi được kiểm tra hình thái, nhuộm Gram, catalase, oxidase, các dòng vi khuẩn phân lập được nhuộm bào tử theo phương pháp nhuộm bào tử của Nguyễn Đức Lượng và ctv. (2006). Kết quả thí nghiệm cho thấy 17 dòng vi khuẩn phân lập đều không hình thành bào tử, do tế bào sau khi được nhuộm chỉ bắt màu đỏ của Safranin chứ không bắt màu xanh của Malachite green (Hình 8).
a b
Hình 8. Các dòng vi khuẩn phân lập không có bào tử khi nhuộm và quan sát ở độ phóng đại 1000 lần
a. Dòng CT2-TB14 b. Dòng CT1-TB6
Bảng 9: Tổng hợp các đặc điểm hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập
Stt Dòng Hình dạng
tế bào Gram
Sự hình thành
bào tử Catalase Oxidase
1 CT1-TB1 Que dài + - - - 2 CT1-TB2 Que ngắn + - - - 3 CT1-TB3 Que dài + - - - 4 CT1-TB6 Que ngắn + - - - 5 CT1-TB9 Que ngắn + - - - 6 CT2-TB4 Que dài + - - - 7 CT2-TB7 Que ngắn + - - - 8 Que ngắn Que ngắn + - - - 9 CT2-TB14 Que dài + - - - 10 CT2-TB18 Que ngắn + - - - 11 CT3-TB8 Que ngắn + - - - 12 CTR1-LV1 Que dài + - - - 13 CTR1-LV3 Que dài + - - - 14 CTR1-LV4 Que ngắn + - - - 15 CTR1-LV6 Que dài + - - - 16 CTR1-LV8 Que ngắn + - - - 17 CTR1-LV9 Que dài + - - - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Qua kết quả kiểm tra một số đặc tính hình thái (Bảng 7, Bảng 8) và đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập được (Bảng 9) cho thấy có những đặc điểm sau: trên môi trường MRS agar sau 48 giờ cấy khuẩn lạc có hình dạng tròn, bóng, bìa nguyên nhô cao hoặc lài, có màu trắng đục. Tế bào có hình que ngắn hoặc dài, không chuyển động, Gram dương, catalase âm tính, oxidase âm tính, không hình thành bào tử. Đặc tính này của các dòng vi khuẩn phân lập phù hợp với công bố của Kandler and Wiss (1986) về đặc điểm của giống Lactobacillus như: khuẩn lạc có bìa nguyên, lồi, trơn láng, bóng, tế bào có dạng hình que thẳng hoặc cong, dài hoặc ngắn, không di động, không hình thành bào tử, Gram dương, catalase và oxidase âm tính.
Vì vậy, có thể kết luận được rằng 17 dòng vi khuẩn phân lập được từ dạ dày-ruột của các mẫu cá tra, cá trê thu mẫu ở 2 tỉnh, thành phố thuộc ĐBSCL (Đồng Tháp, Vĩnh Long) là vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus.
4.2 Khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của 17 dòng vi khuẩn
Lactobacillus spp. phân lập đƣợc 4.2.1 Phƣơng pháp nhỏ giọt
Tất cả 17 dòng Lactobacillus spp. phân lập được, mỗi dòng được nuôi trong 3 ống nghiệm chứa 9 mL môi trường MRS broth và được ủ ở 30oC trong 24 giờ. Sau khi ủ các dòng này tiến hành kiểm tra khả năng ức chế lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp nhỏ giọt. Những dòng có khả năng ức chế sẽ tạo vòng vô khuẩn xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus spp. (Hình 9 ).
Hình 9. Khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của các dòng CT1-TB1 phân lập khi đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp nhỏ giọt
Bảng 10: Khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của các dòng
Lactobacillus spp. phân lập khi đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp nhỏ giọt Stt Dòng vi khuẩn Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Đƣờng kính vòng vô khuẩn ** (mm) (x) Khả năng ức chế 1 CT1-TB1 22,67a 23 +++ 2 CT1-TB2 6,67de 7 ++ 3 CT1-TB3 0f 0 - 4 CT1-TB6 16,0bc 16 ++ 5 CT1-TB9 4,67e 5 + 6 CT2-TB4 9,67d 10 ++ 7 CT2-TB7 16,3bc 16 ++ 8 CT2-TB11 19,67ab 20 +++ 9 CT2-TB14 0f 0 - 10 CT2-TB18 13,67c 14 ++ 11 CT3-TB8 0f 0 - 12 CTR1-LV1 0f 0 - 13 CTR1-LV3 0f 0 - 14 CTR1-LV4 0f 0 - 15 CTR1-LV6 0f 0 - 16 CTR1-LV8 0f 0 - 17 CTR1-LV9 0f 0 - CV (%) 45,90 45,92
Ghi chú: **số liệu đường kính vòng vô khuẩn đã được làm tròn; (-) không có vòng vô khuẩn, (+) khi 1 ≤ x ≤ 5 mm, (++) khi 6 ≤ x ≤20 mm, (+++) khi 21 ≤ x ≤ 60 mm; Số liệu về đường kính vòng vô khuẩn là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột, các số có ít nhất 1 chữ cái theo sau giống nhau thì không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%.
Qua kết quả thí nghiệm (Bảng 10) cho thấy trong 17 dòng vi khuẩn Lactobacillus
spp. phân lập được, dòng CT1-TB1 tạo đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất (22,67 mm) khác biệt không ý nghĩa so với dòng CT2-TB11 (19, 67 mm)nhưng khác biệt ý nghĩa so với các dòng còn lại.
Xét về khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, 17 dòng Lactobacillus spp. phân lập thì có 8 dòng Lactobacillus spp. có khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Galindo, 2004). Trong đó có 2 dòng (CT1-TB1 và CT2-TB11) ức chế mạnh
Edwardsiella ictaluri (đường kính vòng vô khuẩn là 23 mm và 20 mm), 5 dòng (CT1- TB2, CT1-TB6, CT2-TB4, CT2-TB7, CT2-TB18) có khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri với mức độ ức chế trung bình (đường kính vòng vô khuẩn từ 6 mm đến 20 mm), 1 dòng (CT1-TB9) có mức độ ức chế yếu Edwardsiella ictaluri (đường kính vòng vô khuẩn từ 1 mm đến 5 mm) và có 9 dòng (CT1-TB3, CT2-TB14, CTR1-LV1, CTR1- LV3, CTR1-LV4, CTR1-LV6, CTR1-LV8, CTR1-LV9) không có khả năng ức chế
Edwardsiella ictaluri.
Như vậy, qua kết quả kiểm tra khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp nhỏ giọt (Bảng 11), 17 dòng Lactobacillus spp. phân lập được, 8 dòng có khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri (chiếm 47%) và 9 dòng Lactobacillus spp. không có khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri (chiếm 53%). Dòng CT1-TB1 là dòng vi khuẩn được phân lập từ cá trê nuôi theo mô hình bán thâm canh (cho cá ăn bằng thức ăn công nghiệp) ở huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long có khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri mạnh nhất. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào khả năng ức chế của tất cả các thành phần mà Lactobacillus sp. sinh ra trong môi trường MRS broth (acid lactic, ethanol, diacetyl, bacteriocin,…) lên dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri do đó dù dòng CT1- TB1 có khả năng tạo đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất nhưng cũng chưa thể kết luận khả năng đó là do bacteriocin của dòng CT1-TB1 tạo ra nên phải tiếp tục tiến hành kiểm tra khả năng ức chế bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
4.2.2 Phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch
Tất cả 17 dòng Lactobacillus spp. phân lập sẽ được kiểm tra khả năng hình thành bacteriocin bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
Bảng 11: Khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của các dòng vi khuẩn
Lactobacillus spp. phân lập bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch Stt Dòng vi khuẩn Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Đƣờng kính vòng vô khuẩn ** (mm) (x) Khả năng ức chế 1 CT1-TB1 0 8 - 2 CT1-TB2 0 6 - 3 CT1-TB3 0 0 - 4 CT1-TB6 0 0 - 5 CT1-TB9 0 0 - 6 CT2-TB4 0 0 - 7 CT2-TB7 15,0a 15 ++ 8 CT2-TB11 11,67b 12 ++ 9 CT2-TB14 0 0 - 10 CT2-TB18 0 9 - 11 CT3-TB8 0 0 - 12 CTR1-LV1 0 0 - 13 CTR1-LV3 0 10 - 14 CTR1-LV4 0 0 - 15 CTR1-LV6 0 0 - 16 CTR1-LV8 0 10 - 17 CTR1-LV9 0 0 - CV (%) 17,66 15,71
Ghi chú: **số liệu đường kính vòng vô khuẩn đã được làm tròn; (-) không có vòng vô khuẩn, (+) khi 1 ≤ x ≤ 5 mm, (++) khi 6 ≤ x ≤20 mm, (+++) khi 21 ≤ x ≤ 60 mm; Số liệu về đường kính vòng vô khuẩn là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột, các số có ít nhất 1 chữ cái theo sau giống nhau thì không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%.
Qua kết quả thí nghiệm (Bảng 11) cho thấy trong tổng số 17 dòng Lactobacillus
spp. phân lập được, tiến hành kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch có 2 dòng Lactobacillus spp. có khả năng ức chế được vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (chiếm 11,8 %).
Do được nuôi trong điều kiện kỵ khí và tĩnh để tránh sự hình thành H2O2 và pH dịch nuôi đã được đưa về 6,0 nên có thể kết luận rằng khả năng ức chế này là do bacteriocin mà dòng CT2-TB7 sinh ra trong quá trình sinh trưởng (Hình 10).
Hình 10. Khả năng ức chế của bacteriocin do dòng Lactobacillus spp. sinh ra lên Edwardsiella ictaluri (Dòng CT2-TB7)
Dòng CT2-TB7 tạo đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất (15 mm) trong 17 dòng
Lactobacillus spp. phân lập được. Xét về mặt thống kê, đường kính vòng vô khuẩn do dòng CT2-TB7 tạo ra khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê so với đường kính vòng vô khuẩn được tạo ra dòng Lactobacillus spp. CT2-TB11 còn lại.
Kết quả thí nghiệm này cho thấy tiềm năng sử dụng bacteriocin được sinh ra từ dòng CT2-TB7 để điều trị bệnh gan thận mủ cho cá tra.