3.2.1. Dụng cụ, thiết bị
a. Dụng cụ:
- Đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong, cối nghiền mẫu - Bình Erlenmeyer 100-500-mL
- Que cấy, đèn cồn, lame và lamelle, kẹp - Các loại tuýp 1,5-mL, 2-mL
- Đầu col xanh, vàng, trắng
b. Thiết bị:
- Máy đo OD - Máy Vortex
- pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ) - Cân điện tử Sartorius (Đức)
- Kính hiển vi Olympus CHT ( Nhật) - Cân điện tử Sartorius (Đức)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt - Tủ cấy vi sinh vật (Pháp)
- Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức)
- Tủ lạnh -20C Electrolux Confor Plus (Thụy Điển) - Tủ lạnh -40
- Tủ sấy EHRET (Đức)
- Bộ micropipette Gibson, P20, P100, P1000 (Đức) - Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C (Đức)
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
3.2.2. Nguyên vật liệu
Thu 9 mẫu rễ bắp (thu toàn bộ rễ của mỗi cây) từ các huyện ở 3 tỉnh : - Tỉnh Đồng Nai : Huyện Trảng Bom (1 mẫu), Huyện Thống Nhất (2 mẫu) , Huyện Long Thành (2 mẫu)
- Tỉnh Bình Phước : Huyện Chơn Thành (2 mẫu). - Tp. Hồ Chí Minh : Huyện Củ Chi (2 mẫu).
3.2.3. Hóa chất a. Hoá chất dùng để khử trùng mẫu a. Hoá chất dùng để khử trùng mẫu - Nước cất vô trùng - Ethanol (cồn) 96% - H2O2 b. Hóa chất dùng để phân lập - Môi trường NFb
Bảng 3. Công thức môi trường Nfb (Kirchhof và ctv, 1997)
Thành phần Hàm lượng (g/l) Acid malic 5 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,1 CaCl2 0,02 KOH 4,5 Dd vi lượng(1) 2ml Dd vitamine(2) 1ml Dd FeEDTA 1.64% 4ml
Bromthymol blue 0.5% trong KOH 0.2N 2ml
Agar 18 (môi trường bđ 1,8)
(♦) Bđ : Bán đặc
(1)
Dd vi lượng: Na2MoO4.2H2O: 1g; MnSO4.H2O: 1,5g; H2BO3: 1,4g; CuSO4: 0,4g; ZnSO4.7H2O: 0,12g; Thêm nước cất cho đủ 1000ml
(2)
Dd vitamine: Biotin: 10mg; Pyridoxyl-HCl: 20mg; thêm nước cất cho đủ 100ml
- Môi trường LGI
Bảng 4. Công thức môi trường LGI (Cavalcante và Dobereiner, 1988)
Thành phần Hàm lượng (g/l) Sucrose 10 KH2PO4 0,6 K2HPO4 0,2 MgSO4.7H2O 0,2 CaCl2 0,02 FeCl3 0.01 Na2MoO4 0,002 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bromthymol blue 0.5% trong KOH 0.2N 5ml
Agar 18 (môi trường bđ 1,8)
pH 5,5
c. Hoá chất kiểm tra khả năng hòa tan Lân - Môi trường NBRIP
Bảng 5. Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)
Thành phần Hàm lượng (g/l) Glucose 10 (NH4)2SO4 0,1 MgSO4.7H2O 0,25 MgCl2.6H2O 0,5 KCl 0,2
Ca3(PO4)2 (hoặc hydroxy-apatite) 5
Bromothymol Blue (0,5%) 5ml
Agar 18
pH 7,2
d. Hoá chất kiểm tra khả năng cố định nitơ
- Môi trường Burk’s không đạm
Bảng 6. Công thức môi trường Burk’s không đạm (Park et al., 2005)
Thành phần Hàm lượng (g/l) Sucrose 10 KH2PO4 0,41 K2HPO4 0,52 Na2SO4 0,05 CaCl2 0,2 MgSO4.7H2O 0,1 FeSO4.7H2O 0.005 Na2MoO4 0,0025
Agar 18 (môi trường bđ 1,8)
pH 5,5
3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Thu mẫu 3.3.1. Thu mẫu
Thu mẫu tại nhiều địa điểm : Huyện Trảng Bom (1 mẫu), Huyện Thống Nhất (2 mẫu) , Huyện Long Thành (2 mẫu); Huyện Chơn Thành (2 mẫu); Huyện Củ Chi (2 mẫu). Chọn các cây có màu xanh tươi tốt, thích hợp nhất là các cây đang giai đoạn ra hoa, tăng trưởng mạnh. Dùng dao bén xắn xung quanh gốc, không cho đứt rễ.
3.3.2 Xử lí mẫu
Rửa mẫu dưới vòi nước chảy mạnh cho sạch đất, rửa lại 2 lần bằng nước cất, để ráo tự nhiên. Dùng dao bén tách rời rễ thành từng đoạn nhỏ 1 cm để riêng trong các bọc nilon sạch, bảo quản trong tủ lạnh -5oC nếu chưa phân lập.
3.3.3. Khử trùng mẫu
Mẫu rễ được khử trùng bề mặt như sau: Cho mẫu vào bình tam giác 100 ml, sau đó cho cồn 96% vào bình tam giác vừa ngập mẫu, lắc nhẹ trong 3 phút, tiếp tục khử trùng bằng H2O2 3% trong 3 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng 4-5 lần.
3.3.4 Phân lập
Lấy khoảng 2 gram mẫu rễ cho vào cối vô trùng, giã nhuyễn, thêm 0.5-1 ml nước cất vô trùng vào cối, trộn và hút phần dịch trích mẫu cho vào tube 1.5 ml. Rút lấy 100l phần dung dịch trong bên trên và cấy vào các ống nghiệm có chứa môi trường LGI và NFb (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần), sau đó đậy nắp các ống nghiệm lại và đem ủ khoảng 2-3 ngày.
Sau 2-3 ngày quan sát ống nghiệm thấy có một lớp màng mỏng sậm màu cách bề mặt môi trường 2-5 mm , đó là dấu hiệu chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh, lần lượt cấy chuyển sang môi trường LGI và NFb đặc.
Vòng pellicle
Hình 2. Vòng Pellicle sau hai ngày chủng mẫu (25.08.2013)
Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chạm nhẹ vào lớp màng mỏng để lấy vi khuẩn trãi lên đĩa chứa môi trường đặc (đường cấy thứ nhất), tiếp tục vẽ đường cấy thứ hai cắt vuông góc đường cấy thứ nhất và đường cấy thứ ba cắt vuông góc với đường cấy thứ hai để tách rời khuẩn lạc (giữa các lần vẽ phải khử trùng que cấy) và ủ ở 30oC. Sau 1-2 ngày chọn những khuẩn lạc rời, đều nhau nằm trên đường
cấy, cấy chuyển sang môi trường khác cho đến khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng. Sau đó chuyển mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc ủ trong 2 ngày để vi khuẩn phát triển, sau đó trữ ở -5oC.
3.3.5. Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên môi trường phân lập đặc ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên đối với các dạng khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì ta sử dụng kích lúp để quan sát.
3.3.6. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp.
- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn
- Nhỏ 15 µl nước cất vô trùng lên kính mang vật (lame) - Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật
- Đậy kính đậy vật (lammelle) lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho mẫu vật không có bọt khí.
- Tiến hành quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần để thấy được hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
3.3.7. Xác định đặc tính của các dòng vi khuẩn phân lập được a. Khả năng cố định đạm và định lượng đạm tổng hợp được
* Khả năng cố định đạm
Vi khuẩn cố định đạm có thể phát triển tốt trên môi trường không đạm do chúng có khả năng tổng hợp đạm từ không khí. Cấy chuyển tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Burk’s không đạm ủ ở 30oC và theo dõi sự phát triển của chúng trong 3 ngày. Dòng nào phát triển được trên môi trường Burk’s không đạm thì có khả năng cố định đạm.
* Định lượng đạm tổng hợp được
Tiến hành nhân giống vi khuẩn trên môi trường NFb và LGI trong các ống nghiệm.
Hút 1 ml mẫu vi khuẩn sau khi nhân giống cho vào 20 ml môi trường Bruk’s không đạm lỏng trong trong các ống pancol, để trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút, nuôi trong 8 ngày mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần cùng với đối chứng (không chủng vi khuẩn).
Lấy mẫu vào các thời điểm 2, 4, 6, và 8 ngày để xác định hàm lượng ammonium (NH4+) vi khuẩn tổng hợp được bằng phương pháp so màu Oniani. Ion NH4+ trong dung dịch sẽ phản ứng với phenol dưới sự hiện diện của ion hypocholoride trong môi trường kiềm tạo thành indophenol có màu xanh lá cây.
Chuẩn bị hoá chất đo đạm:
- Nitroprusside: Cân 5g phenol và 0,025g Phenol-nitroprusside có thêm 0,5 lít nước cho vào cốc.
- Sodium hypochloride: Pha 15 ml hypochloride với 5g NaOH và 0,5 lít nước cho vào cốc.
- Dung dịch chuẩn NH4+ 1 mg/l.
Tiến hành dựng đường chuẩn đo đạm
Bảng 7: Đường chuẩn đo đạm
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nước khử khoáng 2,5ml 2ml 1,5ml 1ml 0,5ml 0ml NH4 + Chuẩn (1mg/l) 0ml 0,5ml 1ml 1,5ml 2ml 2,5ml EDTA 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml Phenol-Nitroprusside 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Sodium hypochloride 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml
Đo mẫu
- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn cho vào tuýp 2-ml, ly tâm 12000 vòng/phút/5phút.
- Sau đó hút 0,5 ml dịch sau ly tâm cho vào ống nghiệm có chứa 2 ml H2O khử khoáng, kế đến bổ sung 2,5 ml Phenol-nitroprusside và 2,5 ml sodium hypochloride, vortex và để ổn định khoảng 15 phút tiến hành đo OD bước sóng 636 nm (OD640nm) - Dựa vào phương trình đường chuẩn: Y= a*x + b
Trong đó: x là nồng độ của mẫu (mg/l) Y là độ hấp thụ quang.
Sau đó, đo độ hấp thụ quang của mẫu cần phân tích để tính hàm lượng NH4 +
theo công thức: x= (y – b)/a.
b. Khả năng hòa tan lân và định lượng lân hòa tan được * Khả năng hòa tan lân
Cấy chuyển tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường NBRIP đặc ủ ở 30oC và theo dõi sự phát triển trong 3 ngày. Dòng nào phát triển được trên môi trường NBRIP thì có khả năng hòa tan lân. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Định lượng lân hòa tan được
Tiến hành nhân giống vi khuẩn trên môi trường NFb và LGI lỏng trong các ống nghiệm.
Hút 1 ml mẫu vi khuẩn sau khi nhân giống cho vào 20 ml môi trường NBRIP trong trong các ống fancol, để trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút, nuôi trong 20 ngày mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần cùng với đối chứng (không chủng vi khuẩn).
(Chú ý: Để định lượng lân môi trườngNBRIP không để Bromothymol Blue)
Lấy mẫu vào các thời điểm 5, 10, 15, và 20 ngày để khảo sát khả năng hoà tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp so màu Oniani. Hàm lượng P2O5 được hoà tan trong môi trường tác dụng với amoniummolypdate trong môi trường acid tạo thành chất phosphomolypdate màu vàng. Dưới sự hiện diện của chất khử Mo6+ bị khử thành Mo3+ làm cho dung dịch có màu xanh dương. Màu xanh dương chỉ thị vi khuẩn có khả năng hoà tan lân.
Chuẩn bị hoá chất đo lân : - Dung dịch A:
(1): Cân 12 gam (NH4)6MO24.4H2O (amoniummolypdate), sau đó thêm 250 H2O vào cốc và khoấy tan.
(2): Cân 0,2908 gam KsbOC4H2O6 (potassium antymonyl tartrate), sau đó thêm 100 ml H2O vào cốc.
(3): Thêm H2O vào cốc có chứa 140 ml H2SO4 đậm đặc cho đủ lượng 1lít. (4): Trộn chung hỗn hợp (1), (2), (3), sau đó thêm H2O đủ lượng 2 lít.
- Dung dịch B: Cân 1,050 g acid ascorbic vào cốc, thêm 200 ml dung dịch A.
Tiến hành dựng đường chuẩn đo lân Bảng 8: Đường chuẩn đo lân
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nước khử khoáng 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml P2O5 Chuẩn (1mg/l) 0ml 0,5ml 1ml 1,5ml 2ml 2,5ml Dung dịch B 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml Sodium hypochloride 3,5ml 3ml 2,5ml 2ml 1,5ml 1ml Đo mẫu
- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn cho vào tuýp 2-ml, ly tâm 12000 vòng/phút/5phút.
- Hút 0,5 ml dịch sau ly tâm cho vào ống nghiệm có chứa 5 ml H2O khử khoáng, sau đó bổ sung 4 ml dung dịch B và 3,5 ml H20 khử khoáng, khoấy hỗn hợp, để ổn định khoảng 15 phút tiến hành đo OD bước sóng 880 nm.
c. Khả năng tổng hợp IAA
Tiến hành nhân giống vi khuẩn trên môi trường NFb và LGI lỏng trong các ống nghiệm.
Hút 100 µl mẫu vi khuẩn sau khi nhân giống cho vào 2 ml môi trường NFb và LGI có và không có bổ sung tryptophan trong các effendof (2 ml), để trong bóng tối, nuôi trong 8 ngày mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần cùng với đối chứng (không chủng vi khuẩn).
Lấy mẫu vào các thời điểm 2, 4, 6, và 8 ngày để xác định hàm lượng IAA vi khuẩn tổng hợp được bằng phương pháp so màu Salkowsky ở bước sóng 530 nm. IAA được tạo ra trong dung dịch sẽ phản ứng với thuốc thử tạo thành dung dịch có màu hồng xậm tùy thuộc vào IAA do vi khuẩn tạo ra.
Chuẩn bị thuốc thử Salkowsky
- Đong 533 ml H2SO4 đậm đặc vào bình đựng chuẩn, thêm từ từ nước cất vào đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H2SO4 đậm đặc.
- Cân 4,5 gam FeCl3 cho vào cốc, thêm từ từ dung dịch H2SO4 đậm đặc 10.8 M vào cốc và khoấy cho FeCl3 tan đều, để nguội. Bảo quản trong chai xậm màu.
Tiến hành dựng đường chuẩn đo IAA Bảng 9: Đường chuẩn đo IAA.
Ống nghiệm 0 1 2 3 4
Nước khử khoáng 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
Thuốc thử 1ml 1ml 1ml 1ml ml
IAA chuẩn 0µl 2µl 4µl 6µl 8µl
Đo mẫu
- Lấy mẫu ở các thời điểm 2, 4, 6, và 8 ngày sau khi nuôi, ly tâm 12000 vòng/phút/5 phút.
-Sau khi ly tâm hút 0,5 ml lấy dịch vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa 0,5 ml H2O khử khoáng và 1 ml thuốc thử Salkowki để ổn định khoảng 15 phút trong tối, tiến hành đo OD bước sống 530 nm .
CHƯƠNG 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập được
Từ 5 mẫu rễ bắp thu ở tỉnh Đồng Nai và 2 mẫu rễ bắp thu ở tỉnh Bình phước và 2 mẫu rễ bắp thu được ở Tp. Hồ Chí Minh đã phân lập được 50 dòng vi khuẩn. Trong số 50 dòng vi khuẩn đã phân lập, có 34 dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ bắp ở tỉnh Đồng Nai (20 dòng NFb và 14 dòng LGI), 8 dòng phân lập được từ mẫu rễ bắp ở tỉnh Bình Phước (4 dòng NFb và 4 dòng LGI) và 7 dòng phân lập được từ mẫu rễ bắp ở Tp. Hồ Chí Minh (4 dòng LGI và 3 dòng NFB).
4.1.1. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập Bảng 10. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được Bảng 10. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được
STT
Vi
Khuẩn Nguồn gốc các dòng vi khuẩn MT
1 ĐRL1a Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai LGI
2 ĐRL1b Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai LGI
3 ĐRL1c Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai LGI
4 ĐRL1d Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai LGI
5 ĐRL1e Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai LGI
6 ĐRL2a Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai LGI
7 ĐRL2b Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai LGI
8 ĐRL2c Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai LGI
9 ĐRL2d Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai LGI
10 ĐRL2e Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai LGI
11 ĐRL2f Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai LGI
12 ĐRL3a Ấp Lộ 25, Bàu Hàm 2, Thống Nhất, Đồng Nai LGI 13 ĐRL3c Ấp Lộ 25, Bàu Hàm 2, Thống Nhất, Đồng Nai LGI 14 ĐRL3d Ấp Lộ 25, Bàu Hàm 2, Thống Nhất, Đồng Nai LGI
15 PRL1a Ấp 4, Nha Bích, Chơn Thành, Bình Phước LGI
16 PRL1b Ấp 4, Nha Bích, Chơn Thành, Bình Phước LGI
17 PRL1c Ấp 4, Nha Bích, Chơn Thành, Bình Phước LGI
18 PRL1d Ấp 4, Nha Bích, Chơn Thành, Bình Phước LGI
19 HRL1a Xã Tân Thông Hội, Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh LGI 20 HRL1b Xã Tân Thông Hội, Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh LGI 21 HRL2a Xã Tân Phú Hưng, Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh LGI 22 HRL2b Xã Tân Phú Hưng, Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh LGI
23 ĐRN1a Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai NFB
24 ĐRN1b Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai NFB
25 ĐRN1c Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai NFB
27 ĐRN1e Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai NFB
28 ĐRN1f Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai NFB
29 ĐRN1g Ấp Nam, Trung Hòa, Trảng Bom, Đồng Nai NFB
30 ĐRN2a Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai NFB 31 ĐRN2b Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai NFB 32 ĐRN2c Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai NFB 33 ĐRN2d Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai NFB 34 ĐRN2e Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai NFB 35 ĐRN2f Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai NFB 36 ĐRN2g Ấp 2, Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai NFB (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
37 ĐRN3a Ấp Lộ 25, Bàu Hàm 2, Thống Nhất, Đồng Nai NFB 38 ĐRN3b Ấp Lộ 25, Bàu Hàm 2, Thống Nhất, Đồng Nai NFB 39 ĐRN3c Ấp Lộ 25, Bàu Hàm 2, Thống Nhất, Đồng Nai NFB 40 ĐRN3d Ấp Lộ 25, Bàu Hàm 2, Thống Nhất, Đồng Nai NFB