a. Phương pháp xác định mật số vi sinh vật (phương pháp đếm sống)
Phương pháp pha loãng mẫu
- Lấy 100L mẫu chứa vi khuẩn cho vào eppendorf đã chứa 900L nước cất đã được khử trùng trước.
- Lắc đều bằng máy lắc cơ học, được độ pha loãng 10-1. Tiếp tục lấy 100L dịch pha loãng ở nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm có chứa 900L nước cất đã khử trùng, ta được độ pha loãng 10-2.
- Tương tự như trên, ta sẽ được dãy nồng độ pha loãng, 10-3, 10-4, 10-5,…
- Tùy theo sự ước đoán mật số vi khuẩn trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít. Trong đề tài này, mật số vi khuẩn được khảo sát ở độ pha loãng khoảng 10-8. - Sau khi có độ pha loãng thích hợp thì tiến hành xác định mật số vi khuẩn.
Phương pháp kiểm tra
- Ở mỗi nồng độ pha loãng dùng pipet vô trùng lấy 100L cấy lên 2 đĩa petri đã chứa sẵn môi trường agar thích hợp.
- Dùng que gạt để phân phối giọt dịch đều khắp mặt đĩa petri tạo điều kiện thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng.
- Đặt các đĩa petri vào tủ ấm, ủ ở 37oC trong 24 giờ.
- Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 100L mẫu theo công thức đã nêu trên.
Cách tính kết quả
Mật số tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức là:
Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình/đĩa Dilà độ pha loãng
V là dung dịch huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa petri (mL)
Mật số tế bào trung bình Mi trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
b. Phương pháp xác định tỷ lệ bã bia bị phân giải Mục đích:
Xác định được tỉ lệ % bã bia bị phân giải, qua đó đánh giá được khả năng phân giải bã bia của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium BN9.
Cách tiến hành:
Trong từng nghiệm thức ở các thí nghiệm, sau 7 ngày ủ lắc, tiến hành lọc môi trường qua giấy lọc đã cân khối lượng trước đó. (Giấy lọc đã được sấy khô ở 80oC cho đến khi khối lượng không đổi).
Khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn được xác định bằng cách cân lượng bã bia khô còn lại trongmôi trường sau khi đã lọc và sấy khô ở 80oC đến khi khối lượng không đổi (2 ngày) để tính khối lượng bã bia bị tiêu hao trong quá trình nuôi cấy.
Tính kết quả:
Tỉ lệ phần trăm bã bia bị phân giải bởi vi khuẩnđược tính theo công thức sau:
Trong đó: A(%) là tỉ lệ bã bia bị phân giải bởi vi khuẩn; mBĐ là khối lượng bã bia ban đầu;
mC là khối lượng bã bia còn lại sau khi bị phân giải.
c. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm được phân tích thống kê và vẽ đồ thị bằng phần mềm Minitab 16 và MS Excel 2007.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Sự phát triển của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9 theo thời gian
Đường sinh trưởng của vi khuẩn thể hiện các giai đoạn phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy. Nhờ vào đó người làm nghiên cứu có thể xác định được thời điểm thích hợp để tiến hành thực hiện các thí nghiệm.
Hình 4. Sự thay đổi mật số vi khuẩn theo thời gian (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ghi chú: các giá trị đã chuyển dạng log thể hiện trên hình là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Kết quả khảo sát sự phát triển của vi khuẩn B. megaterium BN9 cho thấy mật số vi khuẩn tăng lên mỗi ngày từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 3 và có dấu hiệu giảm dần từ ngày thứ 4 (Hình 4). Ở ngày thứ 1, 2 mật số vi khuẩn có sự thay đổi, mật số vi khuẩn tăng từ 9,01 log CFU/mL lên 9,17 log CFU/mL. Ở ngày thứ 3 mật số vi khuẩn đạt cao nhất là 9,36 log CFU/mL, và sau đó mật số vi khuẩn giảm ở các ngày tiếp theo và thấp nhất ở ngày thứ 7 (9,04 log CFU/mL).
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 2.1) cho thấy có sự tăng mật số từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 2 khác biệt có ý nghĩa thống kê nhưng mật số tăng chậm hơn so với ngày thứ 3. Điều này cũng phù hợp với nguyên lý phát triển của vi khuẩn nói chung, thời gian này vi khuẩn đang ở giai đoạn log phase hay pha chỉ số. Ở giai đoạn này, vi khuẩn cần có thời gian thích nghi và tổng hợp hệ enzyme cần thiết để phân giải nguồn dinh dưỡng trong môi trường. Sau khi đã thích nghi với môi trường, vi khuẩn bắt đầu
tăng trưởng nhanh và đạt mật số cao nhất ở ngày thứ 3, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các ngày thứ 1, thứ 2, thứ 4, thứ 5, thứ 6, thứ 7. Như vậy có thể thấy ngày thứ 3 là giai đoạn vi khuẩn đang ở pha ổn định hay gọi là pha cân bằng của quá trình phát triển. Điều này có thể giải thích là từ ngày 1 đến ngày 2 vi khuẩn đã thích nghi với môi trường và từ ngày thứ 2 vi khuẩn bắt đầu phát triển mạnh, sinh tổng hợp nhiều hợp chất dinh dưỡng;đến ngày thứ 3, mật số vi khuẩn ổn định, số lượng tế bào chết đi bằng với số lượng tế bào sinh ra. Từ ngày thứ 4, 5, 6, 7 mật số giảm dần theo thời gian, tương ứng với sự chết dần của vi khuẩn, vi khuẩn bắt đầu đi vào pha chết từ ngày thứ 4. Do đó, ngày thứ 3 được chọn là thời gian nuôi cấy tối ưu của vi khuẩn B. megaterium BN9.
4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9 bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9
Nhiệt độ và pH của môi trường là hai yếu tố thường ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Thông thường khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm. Bên cạnh đó, pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt là ảnh hưởng đến độ bền enzyme.
Bảng 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn
Nhiệt độ pH
Mật số vi khuẩn trung bình (log CFU/mL)
Hiệu suất phân giải trung bình (%) 30°C 4 9,18abc 27,3bcd 30°C 5 9,29ab 29,53b 30°C 6 9,26ab 27,28bcd 30°C 7 9,24abc 25,99bcdef 30°C 8 9,19abc 21,72bcdefghi 30oC 9 9,16abc 17,27efghi 35°C 4 8,33e 17,69cdefghi 35°C 5 9,25abc 26,08bcdef 35°C 6 9,24abc 24,88bcdefg
Nhiệt độ pH Mật số vi khuẩn trung bình (log CFU/mL)
Hiệu suất phân giải trung bình (%) 35°C 7 9,27ab 27,22bcd 35°C 8 9,37a 39,57a 35oC 9 9,27ab 26,13bcde 40°C 4 8,87d 12,18i 40°C 5 9,26ab 25,91bcdef 40°C 6 9,29ab 28,80b 40°C 7 9,30ab 27,54bc 40°C 8 9,27ab 22,83bcdefgh 40oC 9 9,16abc 16,15fghi 45°C 4 8,05f 13,98hi 45°C 5 8,2ef 12,61i 45°C 6 8,33e 17,56defghi 45°C 7 9,10bcd 25,28bcdefg 45°C 8 9,11bcd 18,43cdefghi 45oC 9 8,99cd 15,41ghi
Ghi chú: các giá trị thể hiện trên bảng là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Dựa vào Bảng 10 cho thấy sự tương tác pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển cũng như khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn.
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3, mục 2) cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Mật số vi khuẩn trung bình cao nhất tại nhiệt độ 35oC (9,37 log CFU/mL) và thấp nhất ở nhiệt độ 45oC (8,05 log CFU/mL), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Khả năng phân giải trung bình đạt giá trị cao nhất tại nhiệt độ 35oC (39,57%), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại; thấp nhất ở nhiệt độ 45oC (12,61%). Bên cạnh đó, pH môi trường cũng ảnh hưởng đến mật số vi khuẩn và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn. Khi pH là 4 mật số vi khuẩn trung bình có giá trị thấp nhất (khoảng 8,61 log CFU/mL), khác biệt có ý nghĩa
bình đạt giá trị cao nhất (9,235 log CFU/mL), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Kết quả trên cho thấy ở một số nghiệm thức khi mật số vi khuẩn tăng thì khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn tăng và ngược lại. Tuy nhiên, ở một số nghiệm thức, mật số vi khuẩn tăng những khả năng phân giải bã bia không tăng. Từ đó có thể thấy rằng khảnăng phân giải cơ chất của vi khuẩn không chỉ phụ thuộc vào mật số vi khuẩn mà còn phụ thuộc vào hệ các enzyme do vi khuẩn tiết ra.
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3, mục 2 và hình 7, 8) còn cho thấy sự tương tác pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Mật số vi khuẩn và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn đạt giá trị cao nhất tại 35oC và pH 8 với các giá trị lần lượt là 9,37 log CFU/mL và 39,57%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Mật số vi khuẩn thấp nhất tại 45oC và pH 4 với giá trị là 8,05 log CFU/mL. Hiệu suất phân giải thấp nhất tại 40oC và pH 4 với giá trị là 12,18%. Từ kết quả thí nghiệm này cho thấy môi trường acid pH 4 ở các mức nhiệt độ sau 7 ngày ủ lắc làm ức chế sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn. Nhiệt độ quá cao cũng làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn.
Tóm lại, dựa vào kết quả thí nghiệm cho thấy rằng có sự tương tác giữa hai nhân tố pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn. Giá trị pH 8 và nhiệt độ là 35oC là điều kiện tối ưu cho hoạt động phân giải bã bia và được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triểnvà khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9
Đường là một nguồn carbon đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của nhiều loại vi sinh vật, đường cung cấp nguồn carbohydrate tạo thành các hợp chất cấu tạo nên tế bào và cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của tế bào. Khi bổ sung thêm các nguồn carbon, có thể giúp cho sự phân giải các chất dinh dưỡng nhanh hơn hoặc làm ức chế sự phân giải các chất dinh dưỡng của vi khuẩn. Để xác định ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của chủng vi khuẩn B. megaterium BN9, các nguồn carbon như glucose, sucrose, bột bắp và rỉ đường được bổ sung với nồng độ 1%.
Hình 5. Ảnh hưởng của các nguồn carbon đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn
Ghi chú: các giá trị là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Dựa vào Hình 5 cho thấy khi bổ sung các nguồn dinh dưỡng chứa carbon khác nhau làm cho mật số vi khuẩn giữa các nghiệm thức có sự thay đổi, mật số vi khuẩn đạt cao nhất ở nghiệm thức bổ sung rỉ đường (9,43 log CFU/mL). Xếp sau lần lượt là nghiệm thức đối chứng không bổ sung thêm nguồn carbon (9,37 log CFU/mL), nghiệm thức bổ sung sucrose (9,22 log CFU/mL), nghiệm thức bổ sung glucose (9,1 log CFU/mL) và thấp nhất là nghiệm thức bổ sung bột bắp (8,9 log CFU/mL).
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3, mục 3) cho thấy các nguồn dinh dưỡng chứa carbon khác nhau ảnh hưởng đến mật số vi khuẩn là có ý nghĩa thống kê. Nghiệm thức bổ sung rỉ đường đạt mật số cao nhất nhưng khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng không bổ sung nguồn carbon, nguyên nhân làm cho mật số vi khuẩn ở nghiệm thức bổ sung rỉ đường cao hơn so với các nghiệm thức khác có thể là do trong thành phần rỉ đường có các khoáng chất và vitamin cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn. Nghiệm thức bổ sung bột bắp có mật số vi khuẩn thấp hơn so với
kê. Nghiệm thức bổ sung sucrose và glucose có mật số thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại, chứng tỏ sự có mặt của sucrose và glucose ức chế quá trình phát triển của vi khuẩn.
Hình 5 cũng cho thấy khi bổ sung các nguồn dinh dưỡng chứa carbon khác nhau thì khả năng phân giải bã bia ở các nghiệm thức cũng khác nhau. Phần trăm phân giải đạt cao nhất ở nghiệm thức đối chứng chỉ có bã bia không bổ sung nguồn carbon (38,02%), xếp sau là nghiệm thức bổ sung glucose (21,36%), nghiệm thức bổ sung rỉ đường (17,81%), nghiệm thức bổ sung sucrose (17,44%) và nghiệm thức bổ sung bột bắp cho kết quả phân giải bã bia thấp nhất (13,02%).
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3, mục 3) cho thấy các nguồn dinh dưỡng chứa carbon khác nhau ảnh hưởng đến khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn cũng khác nhau. Nghiệm thức đối chứng không bổ sung nguồn carbon cho khả năng phân giải bã bia cao nhất, khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại ở mức 5%. Các nghiệm thức có bổ sung glucose, sucrose, rỉ đường cho khả năng phân giải bã bia tương đương nhau và khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Ở nghiệm thức bổ sung bột bắp cho khả năng phân giải thấp nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức khác. Mặc dù, rỉ đường là phụ phẩm dễ tìm, rẻ tiền lại chứa thành phần dinh dưỡng phong phú giúp cho sự phát triển và tăng sinh khối của vi khuẩn nhưng rỉ đường lại ức chế quá trình sinh enzyme (Wang , Shih (1999), Cheng et al. (1995)), có thể đây là lý do làm cho khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn ở nghiệm thức bổ sung rỉ đường giảm đi so với nghiệm thức đối chứng. Nghiệm thức bổ sung bột bắp cho khả năng phân giải bã bia thấp nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức có bổ sung các nguồn carbon khác.
Như vậy, trong môi trường bã bia có bổ sung glucose, sucrose hoặc bột bắp với nồng độ 1% làm ức chế sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn B. megaterium BN9. Khi bổ sung rỉ đường với nồng độ 1% mặc dù làm tăng sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn nhưng lại làm giảm khả năng phân giải bã bia. Vì thế, với chủng vi khuẩn B. megaterium BN9 thì nguồn cơ chất là bã bia đã cung cấp đủ dinh dưỡng carbon cho sự phát triển của vi khuẩn với hiệu suất phân giải cơ chất cao nhất mà không cần bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng carbon khác.
4.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9
Nguồn nitơ là một trong những thành phần quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sản sinh enzyme của vi khuẩn. Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của chủng vi khuẩn B. megaterium (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
BN9, các nguồn nitơ như NH4Cl, yeast extract, bột đậu nành và bã đậu nành được bổ sung với nồng độ 0,5%.
Hình 6. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn
Ghi chú: các giá trị là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có