*Kỹ thuật này rất linh hoạt,có tác động lớn nhất trong phân tích các quá trình liên kết với phức hệ 2.
*Phức hệ 2 biểu hiện một hiện tượng được gọi là huỳnh quang biến thiên , trong đó có cường độ của huỳnh quang về các thuộc tính của trung tâm phản ứng phức tạp và liên kết chuỗi vận chuyển điện tử trong một cách chi tiết đáng kể .
*Có một số nhận xét chi tiết về các khía cạnh khác nhau của việc sử dụng huỳnh quang để hiểu phức hệ 2 .
•Kautsky và Hirsch (1931) lần đầu tiên chỉ ra bản chất huỳnh quang biến thiên của chất diệp lục trên cơ sở các quan sát bằng
mắt. trước khi Emerson 1932 và Arnold thí nghiệm (chương 3), và cũng trước khi các khái niệm về chuyển giao năng lượng quang hợp hoặc đơn vị quang hợp đã được hình thành.
•Govindjee (1995) đã cung cấp một lịch sử thú vị của công việc đầu trên chất diệp lục huỳnh quang.
•Chất nhận này đã được biết đến như là Q (cho quencher cái dập ). May mắn thay, những loại hóa chất mà sau này được xác định với Q là một quinon (chất nhận Qa trong phức hệ 2 ), do đó tên Q vẫn được giữ lại. Sau đó phân tích của Warren Butler và đồng nghiệp (Butler, 1978) cung cấp cho nhiều cơ sở của sự hiểu biết hiện tại của chúng ta về hiện tượng này.
Trình tự thời gian của chất diệp lục huỳnh quang
Nếu một lá hoặc một tảo lần đầu tiên thích nghi với bóng tối và sau đó được chiếu sáng bởi một chùm đo rất yếu, bản thân nó quá yếu để gây ra quang hóa học trong một số lượng đáng kể các trung tâm phản ứng, cường độ huỳnh quang được quan sát thấy rất thấp. (Hình 7.16)
Trình tự thời gian của cường độ đặc tính huỳnh quang này thường được gọi là huỳnh quang cảm ứng, hoặc đôi khi là hiệu lực Kautsky.
Việc giải thích về những thay đổi được mô tả : Các bước phản ánh chậm hơn một số quy trình riêng biệt, bao gồm các quy định về chuyển giao năng lượng và cả sự trao đổi cacbon.Sự giải thích thường rất khó khăn, vì nhiều nguyên nhân có thể cho tăng hiệu ứng tương tự .
Sự gia tăng ban đầu của huỳnh quang tương quan với trạng thái sự oxi hoá khử của chất nhận điện QA. Nếu một chất ức chế như DCMU được thêm vào mẫu, huỳnh quang tăng nhanh chóng
đển Fm và sau đó không thay đổi thêm. DCMU khối dòng chảy điện tử từ QA đến QB bởi QB chuyển vị từ vị trí ràng buộc của nó.
Sự gia tăng chậm hơn mà không có chất ức chế do thực tế là cho đến khi vùng chứa quinon ở màng tế bào bắt đầu giảm, QA bị oxi hoá lại nhanh chóng, và năng suất của
huỳnh quang vẫn còn thấp.
Khi vùng chứa quinone trở nên giảm dần dần , ngày càng nhiều của QA trở nên giảm, và sản lượng tăng dần huỳnh quang đến Fm’, mặc dù mối quan hệ giữa cường độ huỳnh quang và số lượng của QA- là không nghiêm chỉnh tuyến tính.
Diện tích dưới đường cong cảm ứng huỳnh quang là tỉ lệ thuận với số lượng các electron mà nó cần để làm giảm vùng chứa quinon.
Loại phân tích huỳnh quang cảm ứng này được sử dụng rộng rãi để kiểm tra việc xử lý hoặc đột biến mà có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ lưu lượng điện tử tuyến tính và vì thế trạng thái của sự rút gọn của QA
Phân tích huỳnh quang thylakoid có thể được sử dụng để có được các ước tính về số lượng của sản lượng lượng tử của quang hóa học trong phức hệ 2 .
Nó được trao theo hình thức đặc trưng cho phức hệ 2 trong công thức 7.5, nơi Φi là sản lượng lượng tử của quá trình
ith, và hằng số tỷ lệ cho các quá trình khác nhau ,có thể khử hoạt tính trạng thái bị kích thích, được tổng kết bởi kp cho quang hoa học, kf cho huỳnh quang, và ko cho tất cả ́
các quá trình khác. ΦI = (7.5) ko kf kp ki + +
Năng suất lượng tử của một quá trình quang hóa học, với biểu tượng, Φp , được cho bởi công thức 7.6:
Φp = ko kf kp kp + + (7.6)
Năng suất lượng tử của huỳnh quang khi tất cả các bẫy được mở ra ở trạng thái Fo được đưa ra bởi công thức 7.7:
Fo = kp kf ko
kf
+
Khi bẫy được đóng cửa, tại trạng thái Fm, tỷ lệ năng xuất không đổi cho quang hoa ́
học là số không, và công thức 7.8 kết quả:
Fm =
ko kf
kf
Nếu sự khác biệt giữa Fm và Fo được giữ và sau đó bị chia bởi Fm , công thức (7.9) được tìm thấy, mà đơn giản hoá của đại số đơn giản đến công thức 7.10
ko kf kf ko kf kp kf ko kf kf Fm Fv Fm Fo Fm + + + − + = = − (7.9) ΦP = ko kf kp kp Fm Fv + + = (7.10)
Một giả định ngầm được thực hiện tất cả các huỳnh quang đến từ phức hệ 2 ,không một sự thay đổi tỷ lệ hằng số khác khi bẫy đi từ mở đến đóng cửa, và tất cả các huỳnh quang quan sát thấy ở cả trạng thái Fo và Fm đến từ một hệ thống đồng nhất trong đó tất cả các
trạng thái kích thích chất diệp lục là tương đương.Giả thiết nay không hợp lệ .
Một công thức hơi khác của phương trình liên quan huỳnh quang và năng suất của lượng tử của phức hệ 2 đã sử dụng rất rộng, bởi vì nó liên quan đến số lượng mà thậm chí còn dễ dàng hơn đo lường hơn FV và Fm .
'' ' Fm Ft Fm − (7.11) φ2 =
Lợi thế của công thức 7.11 là Fo không cần phải được xác định, do đó, các phép đo có thể được thực hiện trong điều kiện ánh sáng mặt trời đầy đủ mà không cần thiết phải hoàn toàn thích nghi bóng tối.
Những nghiên cứu này đã được thực hiện có thể do sự phát triển của các công cụ sử dụng kĩ thuật biến điệu biên độ xung (PAM), trong đó một loạt các xung yếu được cho vào trong
mẫu, và huỳnh quang bị biến điệu được phục hồi bởi sự khuếch đại xung chọn lọc.
Kỹ thuật này loại bỏ bất kỳ sự đóng góp trực tiếp từ ánh sáng quang hoá không bị biến điệu , và chỉ ghi nhận sản lượng của huỳnh quang bị kích thích bởi chùm tia biến điệu mức đo. Nó cũng tương đối không nhạy với những sự nhiễu loạn gây ra bởi ánh sáng loé bão hoà , nên cung cấp một phương pháp đơn giản nhưng mạnh mẽ để đo các tham số huỳnh quang và hiệu suất quang hợp.
Huỳnh quang phát hiện sự tôi ( sự dập tắt ) phi quang hoá :
Quá trình dập tắt phi quang hoá (NPQ) như là một cơ chế điều chỉnh tại phức hệ 2 , lần đầu tiên được phát hiện bởi việc sử dụng các phương pháp huỳnh quang.
Các biểu hiện rõ ràng nhất của hiện tượng cảm ứng của sự dập tắt phi quang hoá là sự thay đổi giá trị Fm trong thời gian chiếu sáng, hình 7.17.
Một mối quan hệ định lượng cho số lượng của kết quả sự dập tắt này được cho bởi công thức 7.12, nơi Fm là giá trị của Fm chỉ thành lập sau khi thích nghi với bóng tối , và Fm’ là giá trị của Fm thành lập sau khi chiếu sáng đã gây ra tình trạng dập tắt . NPQ = ' ' Fm Fm Fm − (7.12)
Mối quan hệ này có thể được sắp xếp lại để cho một phương trình mà là tương tự như phức hệ Stern-
Volmer (Eq.A45), nơi [Q] là nồng độ hiệu quả của cái dập , và KSV là hằng số Stern-Volmer , trong đó phản ánh hiệu quả của các cái dập
KFm Fm Fm + =1 ' sv [Q] (7.13)
Cơ sở vật chất của huỳnh quang biến thiên :
Hiệu quả lớn mà cho phép tăng tới sự gia tăng huỳnh quang ở phức hệ 2 với tích lũy của QA- làm chậm tốc độ của quá trình chuyển giao chính điện tử từ P680* để tạo thành trạng thái cặp gốc P680+Pheo-.
Điều này phần lớn là do sự hiệu lực đẩy tĩnh điện của sự tích điện trên QA-. Sự tích điện âm này tăng năng lượng của trạng thái P680+Pheo-QA- so với
P680+Pheo-QA. Sự đẩy tĩnh điện này ức chế sự tích
điện quá trình phân chia và thúc đẩy sự dịch chuyển sau của sự kích thích các hệ thống ăng ten lớn, nơi diễn ra huỳnh quang.
Một số tăng là do hiện tượng tái hợp phát quang , trong đó trạng thái tích điện-riêng biệt P680+Pheo- tái hợp để tạo thành P680 *, theo sau là trở lại kích thích sự chuyển giao cho hệ thống ăng ten. Theo hầu hết các
trường hợp, P680+ không bao giờ thấy, vì nó như một loài oxy hóa mạnh mà nó tìm thấy một số loài để giảm. Do đó, nó không tham gia vào các hiện tượng bình thường của cảm ứng huỳnh quang trong phức hệ 2 . Phức hệ 1 có một số khác biệt quang trọng so với phức hệ 2 , là tất cả các đóng góp vào thực tế là nó không trưng bày huỳnh quang biến thiên .
Trước tiên, quá trình dịch chuyển điện tử phần lớn là không thể đảo ngược, do gradient oxi hoá khử dốc hơn ở bên chất nhận của phức hệ 1. Điều này nhanh chóng loại bỏ các điện tử rằng được chuyển xa hơn từ P700, so với tình hình tại phức hệ 2.
Hiệu ứng này làm giảm đáng kể xác suất kết hợp phát quang do tính tái kết hợp. Ngoài ra, khoảng cách lớn hơn của chất nhận điện tử làm giảm hiệu lực tĩnh điện của chất nhận bị khử trong quá trình chính dịch chuyển điện tử.
Cuối cùng, một số lượng đáng kể của P700+ là hiện diện trong điều kiện ổn định trạng thái-dòng chảy điện tử thông qua phức hệ 1.Trạng thái dập tắt ăng ten P700+ có hiệu quả như P700, mặc dù cơ chế khá khác nhau. P700+ có lẽ dập tắt ăng-ten bằng cách hình thành một trạng thái bị kích thích của các P700+` phức tạp (P700 **), mà sau đó nhanh chóng phân rã bởi con đường không phát xạ , mặc dù điều này là không chắc chắn được thành lập. Tất cả các hiệu ứng kết hợp để đưa ra kết quả đó sự dập tắt của trạng thái bị kích thích của các sắc tố ăng ten phức hệ 1 diễn ra tại cùng một tỷ lệ không phụ thuộc vào trạng thái oxi hoá khử của chất nhận phức tạp khác hoặc chất cho diệp lục . Vì vậy, huỳnh quang biến thiên không quan sát thấy trong phức hệ 1 .