L Ờ IC ẢM ƠN
2.3.7 Phương pháp xác định độ bền thể gel
Theo phương pháp của Tang et al., (1991)
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.
Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%).
Bước 2: Hoàn tan mẫu
Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue.
Thêm 2 ml KOH 0.2 N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex.
Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 1000C) khoảng 8 phút.
Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong tủ lạnh 20 phút.
Bước 3: Đọc và ghi kết quả
Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel).
Đánh giá độ bền thể gel theo thang điểm của IRRI (1996) như được trình bày ở Bảng 2.5
Bảng 2.5 Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996)
Cấp Loại độ bền thể gel Chiều dài thể gel (mm)
1 rất mềm 80 – 100 3 mềm 61 – 80 5 trung bình 41 – 60 7 cứng 35 – 40 9 rất cứng < 35 2.3.8 Phương pháp xác định nhiệt trở hồ
Theo phương pháp của IRRI (1979)
Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng được thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào dĩa petri.
Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi dĩa.
Đậy dĩa petri, để yên khoảng 24 giờở nhiệt độ phòng.
Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của
Bảng 2.6 Phân cấp nhiệt trở hồ IRRI (1979)
CẤP Độ lan rộng
1 Hạt gạo còn nguyên. 2 Hạt gạo phồng lên.
3 Hạt gạo phồngng lên; viền còn nguyên hay rõ nét. 4 Hạt gạo phồng lên; viền còn nguyên và nở rộng. 5 Hạt rã ra; viền hoàn toàn nở rộng.
6 Hạt tan ra hòa chung với viền.
7 Hạt tan hoàn toàn và quyện vào nhau.
Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức: Cấp trở hồ = N n xi Trong đó: xi : cấp độ trở hồ. n: số hạt có cấp độ trở hồ xi N : số hạt thử nghiệm.
Cấp độ trở hồ được đánh giá theo thang điểm của IRRI (1979) (Bảng 2.7)
Bảng 2.7 Đánh giá nhiệt trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979)
Cấp Độ trở hồ 1 – 3 4 - 5 6 – 7 Cao Trung bình Thấp
2.3.9 Phương pháp phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo
Theo Khush và Paul (1979) để đo chiều dài hạt gạo dùng giấy kẻ li đo
nhiều lần. Mỗi dòng lấy 19 hạt gạo.
Bảng 2.8 Phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo Khush and Paul (1979)
Cấp Chiều dài (mm) Kích thước Cấp Tỷ lệ dài/rộng Hình dạng hạt
1 >7,5 Rất dài 1 >3,0 Thon dài
3 6,61-7,5 Dài 3 2,1-3,0 Trung bình
5 5,51-6,6 Trung bình 5 1,1-2,0 Bầu
7 <5,5 Ngắn 7 <1,0 Tròn
2.3.10 Điện di protein tổng số theo phương pháp SDS-PAGE
(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis).(Bộ Nông
nghiệp Nhật, 1980)
Quy trình gồm 6 bước:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch ly trích: Tris HCL 0,05M (pH=8), SDS 0,2%, Urea 5M và 2- Mercaptoethanol (2-ME) 1%.
Dung dịch làm Gel B: Tris HCL 3M (pH=6,5), SDS 0,4%.
Dung dịch làm Gel C: Acrylamide 29,2%, bis Acrylamide 0,8%, thêm
nước cất đến 100 ml.
Dung dịch đệm điện di: Tris HCL 0,025M, Glycine 0,192M và SDS 0,125%.
Thuốc nhuộm: Comassive Brilliant Blue R250 (CBBR-250) 0,225M
trong Methanol 0,225M, acid acetic, nước cất theo tỷ lệ 44:06:50.
Bước 2: Ly trích mẫu
Lấy 3 mg bột nội nhũ (phần không có phôi) đã nghiền min, cho vào ống 1,5 ml.
Thêm 100 μl dung dịch ly trích. Lắc ít nhất 1 giờ hoặc để qua đêm. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút.
Bước 3: Làm gel
Tùy theo chiều dài, rộng và độ dày của khuôn gel mà thể tích mỗi gel
thay đổi. Sau khi tính được thể tích và phần trăm gel cần có, tra bảng tương
quan giữa lượng và phần gel để xác định thành phần các dung dịch.
Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide và gel cô mẫu 5% Polyacrylamide theo quy trình của Sambrook (1989).
Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide
Lắp kính bộ gel, trộn dung dịch A,C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều, cho vào bộ gel.
Thêm 2 giọt nước trên bề mặt dung dịch gel, để 30-60 phút gel sẽ đông.
Làm gel cô mẫu 5% Polyacrylamide
Loại bỏ lớp nước trên bề mặt gel phân tách, trộn dung dịch B, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều, cho vào bộ gel.
Cài răng lược giữa 2 tấm kính của gel để tạo giếng, thêm 1 giọt nước. Để
30-60 phút gel đông, loại bỏ răng lược, lắp vào khung điện di, cho dung dịch
điện di vào ngập các giếng gel.
Bảng 2.9 Công thức pha dung dịch tạo gel Sambrook (1989)
Hóa chất (1 gel) Gel phân tách 12% (ml) Gel cô mẫu 5% (ml)
30% Acrylamide 2,0 0,17 Nước cất 1,6 0,68 Tris HCL 1,5M (pH=8) 1,3 - Tris HCL 1M (pH=6,8) - 0,13 SDS 10% 0,1 0,03 Amonium persulfate 10% 0,05 0,01 TEMED 0,002 0,001
Bước 4: Tiến hành điện di
Bơm 10 μl dung dịch ly trích mẫu/giếng.
Chạy điện di với hiệu điện thế 20V ở gel cô mẫu và 40V ở gel phân tách.
Bước 5: Nhuộm và rửa gel
Gel được nhuộm trong 2 giờ bằng dung dịch acid acetic:methanol:nước theo tỷ lệ 20:05:75, hoặc rửa trong microwave trong 30 phút
Bước 6: Đọc kết quả, scan và bảo quản mẫu gel
2.3.11 Trắc nghiệm tính kháng rầy nâu (IRRI, 1980)
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khay mạ cải tiến của IRRI (1980), và
đánh giá các chi tiêu theo SES (1980). Các nghiệm thức bao gồm các dòng
Nàng Thơm Chợ Đào đột biến đã chọn, đối chứng, giống chuẩn nhiễm TN1, PTB33 chuẩn kháng rầy cấp 1, với ba lần lặp lại.
Cách tiến hành
Bước 1: Nuôi rầy
Rầy nâu được nuôi trên khay lúa 30 ngày tuổi. Giống lúa được dùng để
nuôi rầy là Jasmine 85. Khay dùng nuôi rầy có kích thước 30x15 cm. Mỗi khay trồng 5-7 bụi lúa. Những khay lúa này được đặt trong tủ có lưới kín bao xung quanh bên trong khay nhựa có chứa đất và một lớp nước khoảng 2-3 cm nhằm tạo ẩm độ cho rầy phát triển. Mỗi ngăn của tủ có khoảng 3-5 khay.
Trước khi thả rầy vào cần làm sạch gốc lúa, tỉa bỏ những bẹ lá già, bẹ gần sát mặt nước, đảm bảo những bẹ mang trứng rầy không bị rơi xuống nước.
Sau khi chuẩn bị khay nuôi rầy, tiến hành bắt rầy cái có bụng to thả vào. Số lượng rầy cái thả vào tùy thuộc vào số lượng giống dùng trong trắc nghiệm và mật độ thả vào. Thông thường một rầy cái cánh ngắn có thể đẻ được 300- 400 trứng, rầy cái cánh dài có thể đẻ được 100 trứng.
Bước 2: Chuẩn bị lúa trắc nghiệm
Hai ngày sau khi thả rầy, tiến hành gieo giống lúa trắc nghiệm (đã được ngâm 24 giờ, ủ 48 giờ trước đó) vào rổ nhựa 30x25 cm, có chứa sẵn một lớp
đất dày 5 cm. Gieo ngẫu nhiên mỗi giống một hàng (Hình 2.2). Mỗi rổ là một lần lặp lại. Sau khi gieo đặt rổ nhựa vào khay nhựa 45x60 cm bên trong có sẵn một lớp nước mỏng 2-3 cm để ngăn ngừa kiến và tạo ẩm độ cho lúa phát triển. Một tuần sau khi gieo tỉa bỏ mỗi hàng chừa 15 cây.
Bước 3: Thả rầy
Khi lúa ở các nghiệm thức được 2-3 lá thật (5-7 ngày tuổi), tiến hành bắt rầy tuổi 1-2 thả vào, mật số 5-8 con/cây. Rầy được thả vào bằng cách cắt ngang cây lúa sau đó gõ nhẹ.
Đánh giá
Lấy chỉ tiêu khi trên 95% giống lúa chuẩn nhiễm chết (hoặc một trong những giống trắc nghiệm chết trên 95% không nhất thiết phải là giống chuẩn
nhiễm). Khả năng kháng rầy được đánh giá theo tiêu chuẩn đánh giá quốc tế
(Standard Evaluation System for Rice, 1980) (Bảng 2.10).
Bảng 2.10 Bảng đánh giá khả năng kháng rầy theo tiêu chuẩn quốc tế (1980)
Phần trăm thiệt hại Phân cấp Đánh giá
0-10 0 Rất kháng 10-20 1 Kháng 20-30 3 Hơi kháng 30-50 5 Hơi nhiễm 50-75 7 Nhiễm 75-100 9 Rất nhiễm 2.3.12 Phương pháp xử lý số liệu
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả vụ 1 (tháng 4 – 8/2014) 3.1.1 Kết quả thử mặn 3.1.1 Kết quả thử mặn
Sau khi nhận 5 dòng Nàng Thơm Chợ Đào đột biến ở thế hệ M4 kháng rầy cấp 1 và thơm, tiến hành thanh lọc mặn ở hai nồng độ 6‰ và 8‰ để chọn ra các dòng có khả năng chịu mặn cao theo tiêu chuẩn cao của IRRI,1997 Bảng 3.1 Khả năng chịu mặn của 5 dòng Nàng Thơm Chợ Đào đột biến thế hệ
M4 ở 6‰, 8‰ Nồng độ 6‰ Nồng độ 8‰ STT Tên dòng Cấp Mức phản ứng Cấp Mức phản ứng 1 M2-1-3-13 5 CCTB 5 CCTB 2 M2-1-3-12 9 Rất nhiễm 9 Rất nhiễm 3 M2-1-3-15 3 Chống chịu 3 Chống chịu 4 M3-2-1-15 3 Chống chịu 3 Chống chịu 5 M3-2-1-18 7 Nhiễm 3 Chống chịu 6 NTCĐ ĐC 3 Chống chịu 3 Chống chịu
7 IR28 9 Rất nhiễm 9 Rất nhiễm
8 Đốc Phụng 3 Chống chịu 5 CCTB
CCTB: chống chịu trung bình
Kết quả trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy dòng M2-1-3-15 và dòng M3-2-1- 15 có khả năng chịu mặn tương đương với NTCĐ đối chứng là cấp 3 ở cả 2 nồng 6‰ và 8‰. Trong khi đó dòng M2-1-3-13, M2-1-3-12, M3-2-1-18 chịu mặn kém hơn. Riêng dòng M3-2-1-18 có sự biểu hiện khác nhau giữa 2 nồng
độ mặn 6‰, 8‰. Ở 6‰ thì dòng M3-2-1-18 là cấp 7 trong khi ở nồng độ 8‰ thì ở cấp 3. Điều này có thể giải thích là do ở thế hệ M4 vẫn chưa thuần nên mẫu hạt bố trí vào khay mặn có thể khác nhau nên biểu hiện về khả năng chịu mặn cũng khác nhau. Do đó chọn 3 dòng M2-1-3-13, M2-1-3-15, M3-2-1-15
để trồng và lấy chỉ tiêu. Khả năng chịu mặn của giống Nàng Thơm Chợ Đào
cũng được tìm thấy trong nghiên cứu của Nguyễn Thanh Tường và ctv., 2011,
điều này cho thấy khả năng chịu mặn của các dòng NTCĐ đột biến là có cơ sở
1: M2-1-3-12; 2: M2-1-3-13; 3: M2-1-3-15; 4: M3-2-1-15; 5: M3-2-1-18; 6: Đối chứng; 7: IR28;
8: Đốc Phụng
Hình 3.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của 5 dòng đột biến và đối chứng ở 8‰ thế hệ M4
3.1.2 Một số chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất của các cá
thể thế hệ M5
Sau khi thanh lọc mặn, chọn những cá thể chống chịu tốt tiến hành nhân trồng trong nhà lưới thế hệ M5, đánh giá các chỉ tiêu nông học. Chọn được 4 dòng có thời gian sinh trưởng tương phù hợp và không ảnh hưởng quang kỳ. Kết quả ghi nhận được ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Đặc điểm nông học của các cá thểở thế hệ M5
STT Cá thể TGST (ngày) Cao cây (cm) Số bông/bụi
1 M2-1-3-13-1(6‰) 126 102 19
2 M2-1-3-15-1(6‰) 117 142 16
3 M2-1-3-15-2(6‰) 138 141 14
4 M3-2-1-15-1(8‰) 139 109 35
5 Đối chứng Chết - -
TGST: Thời gian sinh trưởng (ngày)
So với kết quả của Võ Minh Quân ở cùng điều kiện vụ nghịch thì TGST của các dòng đột biến là tương đối phù hợp khoảng 135 ngày. Riêng dòng M2- 1-3-15-1(6‰) có TGST ngắn hơn 120 ngày. Nhìn chung các dòng đột biến trên phù hợp với mục tiêu chọn lọc đã đề ra là không chịu ảnh hưởng quang kỳ. Do trồng trong vụ nghịch nên NTCĐ đối chứng bị ảnh hưởng quang kỳ vì thế sinh trưởng kém và chết.
Khác với TGST, chiều cao cây có sự chênh lệch lớn so với kết quả của Võ Minh Quân, 2013. Chiều cao cây ở thế hệ M3 (vụ nghịch) trung bình 180cm, trong khi ở thế hệ M5 khoảng 124cm. So với NTCĐ gốc chiều cao cây
ở thế hệ M5 (vụ nghịch) thấp hơn từ 55 cm đến 65 cm (Nguyễn Thị Đoan
Trang, 2007). Chiều cao cây có sự thay đổi theo hướng có lợi vì theo Jennings
et al. (1979), hơn bất cứ đặc tính nào khác, thân rạ thấp và cứng là hai yếu tố
quyết định tính đổ ngã của cây lúa, tuy nhiên so với lúa cao sản chiều cao cây của các dòng đột biến này vẫn còn rất cao, theo Nguyễn Ngọc Đệ (2008) chiều cao cây của lúa cao sản dao động khoảng 90-95 cm là tối hảo, có thể hạn chế được đổ ngã khi trồng ngoài đồng. Do đó cần phải chọn lọc và cải thiện tính trạng cao cây của các dòng đột biến trên để góp phần gia tăng tính kháng đổ
ngã.
Bên cạnh chiều cao cây thì số bông/bụi cũng tăng lên đáng kể ở thế hệ
M5, trung bình khoảng 21 bông/bụi so với 16 bông/bụi ở M3. Riêng dòng M3- 2-1-15-1(8‰) có số bông/bụi vượt trội nhất. Sự thay đổi này rất có lợi vì Nguyễn Đình Giao và ctv. (1997) cho rằng trong bốn yếu tố quyết định năng
suất thì số bông/bụi là yếu tố có quyết định nhất và sớm nhất. Nó có thể đóng góp 74% năng suất, trong khi số hạt và trọng lượng hạt đóng góp 26% năng
suất còn lại.
Các chỉ tiêu về thành phần năng suất thể hiện rõ hơn sự phân ly của các dòng đột biến ở thế hệ M5. Bao gồm trọng lượng 1000 hạt, chiều dài bông, số
hạt chắc trên bông và tỷ lệ hạt chắc thể hiện ở Bảng 3.3 Bảng 3.3 Thành phần năng suất của các cá thể đột biến ở thế hệ M5 STT Cá thể TL 1000 hạt (g) Dài bông (cm) Hạt chắc/bông Tỷ lệ hạt chắc (%) 1 M2-1-3-13-1(6‰) 28,8 25,2 82 67,63 2 M2-1-3-15-1(6‰) 28,4 26,8 94 78,10 3 M2-1-3-15-2(6‰) 26,2 34,1 155 70,78 4 M3-2-1-15-1(8‰) 23,9 25,7 128 80,00 5 Đối chứng Chết - - - TL 1000 hạt: Trọng lượng 1000 hạt (g)
Trọng lượng 1000 hạt trung bình của các dòng đột biến khoảng 26,8g nặng hơn so với thế hệ M3 là 25,1g. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Đệ (2008), ông cho rằng trọng lượng 1000 hạt biến thiên trong khoảng 20-30 g.
Chiều dài bông giảm từ 31,4 cm ở thế hệ M3 xuống còn 28 cm ở thế hệ
M5. Sự chênh lệch này cho thấy các dòng đột biến vẫn chưa thuần vì chiều dài bông là một đặc điểm di truyền của giống nên nó sẽ ổn dịnh qua các vụ trồng (Vũ Văn Liết và ctv., 2004).
Số hạt chắc trên bông cũng giảm đáng kể từ 216 hạt chắc/bông xuống còn 114 hạt chắc/bông, nguyên nhân của sự thay đổi này là do chiều dài bông giảm nên số hạt trên bông cũng giảm theo. Riêng dòng M2-1-3-15-2 (6‰) có số hạt chắc trên bông cao nhất hơn 150 hạt. Số hạt chắc/bông cao hơn kết luận mà Nguyễn Ngọc Đệ (1998) đưa ra, ông cho rằng đối với lúa cấy số hạt chắc
trên bông dao động khoảng 100-120 hạt ở điều kiện ĐBSCL.
Tỷ lệ hạt chắc/bông biến thiên từ 67,63%-80%, với tỷ lệ này thì năng
suất sẽ không đạt tối đa vì Nguyễn Ngọc Đệ (2008) cho rằng, muốn có năng
suất cao thì tỷ lệ hạt chắc phải đạt trên 80%. Theo Nguyễn Ngọc Đệ (1998) tỷ
lệ hạt chắc cao là một yếu tố quan trọng để đạt được năng suất cao, tỷ lệ hạt chắc cao hay thấp tùy thuộc vào số hoa trên bông, đặc tính sinh lý của cây lúa và chịu ảnh hưởng lớn của điều kiện ngoại cảnh.
3.1.3 Một số chỉ tiêu phẩm chất của các cá thể được chọn ở vụ 1
Nàng Thơm Chợ Đào là đặc sản của tỉnh Long An nổi tiếng thơm ngon,
hạt gạo mềm, dẻo được nhiều người trong và ngoài nước ưa chuộng. Tuy
nhiên, mùi thơm cũng như những phẩm chất khác sẽ giảm khi trồng ở nơi
khác. Bảng 3.4 thể hiện mùi thơm, hàm lượng amylose, protein của 4 dòng đột biến ở thế hệ M5 và NTCĐ đối chứng.
Bảng 3.4 Hàm lượng amylose, protein và mùi thơm của các cá thể thế hệ M5
STT Cá thể Amylose (%) Protein (%) Mùi thơm
1 M2-1-3-13-1(6‰) 11,16 5,50 Không thơm