Các polynucleotide kinase enzyme T4, còn gọi là ATP: 5’-dephosphopolynucleotide-5’-phosphotransferase (EC 2.7.1.78) [37211-65-7], thu được từ thể thực khuẩn T4 nhiễm Escherichia coli.
Thuộc tính T4 polynucleotide kinase xúc tác truyền nhóm -phosphate của ATP vào điểm cuối 5’-hydroxy của polynucleotides như DNA hoặc RNA. Nó cũng xúc tác trao đổi điểm cuối nhóm 5’- phốt phát [1860], [1839].
Một đơn vị của T4 polynucleotide kinase được định nghĩa là hoạt động của enzyme cần có để hình thành của 1 nmol axit- 32P ngưng trong 30 phút ở 37 0C[1839].
Các enzyme T4 polynucleotide kinasemigrates như là ezyme duy nhất trong gel điện di sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide. Enzyme duy nhất với một khối lượng phân tử của 33*10^3 dalton đại diện cho một trong bốn tiểu đơn vị giống nhau của phức hợp enzyme hoạt động với một khối lượng phân tử tổng số 140*10^3 dalton [1861], [1847]. Hoạt động mạnh nhất tại pH 7,6 ở 370C và đòi hỏi ion Mg2+ và các thuốc thử như dithiothreitol hoặc 2-mercaptoethanol [1847]. Tác dụng kích thích mạnh ion hoặc các polyamit như spermine hoặc spermidine [1836], [1847] kết quả từ sự ổn định của cấu trúc bậc 3 oligomeric hoạt động của enzym [1861]. Nồng độ ATP ít nhất là 1 mmol / L và một tỷ lệ 5: 1 giữa ATP và điểm tận cùng 5’-hydroxyl cần thiết co tối ưu hóa
phosphoryl [1862]. T4 polynucleotide kinase bị ức chế bởi 50% 7 mmol / L sodiumor kali photphat và lên 75% vào 7 mmol / L của ammonium sulfate [1847]. Ngoài hoạt động kinaza của nó, T4 polynucleotide kinaza cũng thể hiện 3’ -Phosphatase [1863], [1864] Các pH tối ưu của hoạt động này là giữa 5.0 và 6.0 , do đó, khác với các hoạt động kinazas ở pH 7,6.
Enzym T4 polynucleotide kinase được sử dụng để đánh dấu DNA và RNA tại 5’ điểm cuối của nó với dư lượng 32P bằng cách sử dụng ATP [1865], [1862], [1839]. Điểm cuối 5’ của DNA có thể được đánh dấu với T4 polynucleotide kinase bằng cách phosphoryl hóa trực tiếp nhóm 5’-hydroxyl hoặc bằng cách trao đổi, không đánh dấu phóng xạ nhóm DNA-liên kết 5’-phosphoryl và 32P phân tử [1866], [1868], [1818]. Điều kiện thay thế cho cả hai phản ứng này cũng được mô tả cho 5’ đánh dấu điểm cuối của RNA [1829], [1831]. T4 polynucleotide kinase thường được sử dụng trong việc xác định trình tự hóa học của ADN [1837], [1818] và RNA [1829], [1869], [1831], [1832]. Sắp xếp trình tự chuỗi DNA có thể xác định được trình tự của cả hai sợi mã hóa và các sợi không mã hoá. Trình tự của chuỗi mã hóa theo hướng 5’-3’ là tốt sau khi đánh dấu điểm cuối 5’ của DNA với T4 polynucleotide kinase và ATP (Hình 106). Trình tự của chuỗi không mã hoá bổ sung theo hướng 3’-5’ là có thể nếu một lõm 3’ cuối dsDNA được kéo dài với enzyme Klenow và phù hợp mộtP-dNTP như chất nền. 5’-Endlabeling cũng được sử dụng với các điểm hạn chế lập bản đồ bằng một phần phân hủy [1870], [1871]; DNA [1831] hoặc RNA vân tay [1872], [1873]; Footprinting DNA thông qua bảo vệ DNase [1874] hoặc bảo vệ methyl hóa [1875]; nghiên cứu lai [1876]; tổng hợp các chất nền cho DNA hoặc RNA ligase [1877], [1878]; và phân tích trình tự DNA [1879], [2015]. Ngoài ra, hoạt động 3’-phosphatase T4 polynucleotide kinase có thể được sử dụng như một đặc biệt 3’- phosphatase [1863].
5. T4 polynucleotide kinase, 3’- cố định Phosphatase
3’-Phosphatase cố định T4 polynucleotide kinase, còn gọi là ATP: 5'-dephosphopolynucleotide 5'-phosphotransferase (EC 2.7.1.78) [37211-65-7], thu được từ thể thực khuẩn T4 pseT1 nhiễm Escherichia coli.
Thuộc tính T4 3’-Phosphatase cố định polynucleotide kinase là một sản phẩm gen PSE T1 biến đổi T4 trong đó chỉ có hoạt động 3’-phosphatase nhưng không hoạt động 5’-kinase đã bị ảnh hưởng [1863], [1864], [1880], [1881] .
Một đơn vị của 3’-phosphatase cố định T4 polynucleotide kinase được định nghĩa là hoạt động của enzyme cần có để hình thành 1 nmol axit-32P ngưng trong 30 phút ở 370C [1839].
Hoạt động mạnh nhất của phản ứng 5’-kinase thu được trong cùng điều kiện như đối với T4 polynucleotide kinase hoang dại. Tuy nhiên, ngay cả trong điều kiện tối ưu của hoang dại hoạt động 3’-phosphatase, không loại bỏ các nhóm 3’-phosphatase 3’- AMP được quan sát với các đột biến T4 polynucleotide kinase ở pH 5,5-6,0.
Sử dụng 3’-Phosphatase cố địnhT4 polynucleotide kinase là mối quan tâm đặc biệt trong phân tích RNA. Khi không có 3’- phosphatase làm cho enzyme này cực kỳ hữu ích cho việc chuẩn bị của các loài duy nhất RNA phosphoryl hóa ở cả hai 5’ - và 3’ - cuối. Oligoribonucleotides với cả hai 3’ - và phosphat 5’ đầu cuối được sử dụng như chất hỗ trợ trong phản ứng T4 RNA ligase [1882], [1883]. Mặc dù 3’-phosphatase là không cần thiết cho hoạt động với T4 RNA ligase, nó là một nhóm ngăn cản sản phẩm giữa các phân tử được bảo đảm. Sử dụng 3’-phosphatase cố định T4 polynucleotide kinase là việc đánh dấu CMP để cung cấp cho
6. methyl hóa HpaII
Methyl hóa HpaII, còn được gọi là S-adenosyl-L-methionine: DNA (cytosine-5)-methyltransferase (EC 2.1.1.37) [9037-42-7], được lấy từ Haemophilus parainfluenzae.
Thuộc tính methyl hóa HpaII được phân lập từ H. parainfluenzae chứa methyl hóa cúm gia cầm là tốt [1885], [1886]. Methyl hóa dịch cúm gia cầm hoạt động trên DNA sợi đôi bằng cách chuyển nhóm methyl từ S adenosylmethionine để địa điểm nhận dạng xuôi ngược
5’ CCGG 3’
3’GGCC 5’
Kết quả là 5-methyl hóa trong cả hai của cytosines [1885], [1887].
Một đơn vị của methyl hóa HpaII được định nghĩa là hoạt động của enzyme cần thiết để bảo vệ 1 mg lDNA đến> 95% so với phân cắt bởi HpaII endonuclease giới hạn trong 1 giờ ở 37 8C [1885]. Sợi đơn DNA được methyl hóa bởi methyl hóa HpaII có hiệu quả rất thấp. Tuy nhiên, methyl hóa HpaII có khả năng Methyl hóa trình tự nhận biết hemimethylated [2011]. Kể từ khi các cation hóa trị hai như Mg2 + là không cần thiết cho hoạt động của nó, methyl hóa DNA với methyl hóa HpaII có thể được thực hiện trong sự hiện diện của axit Ethylenediaminetetraacetic. Methyl hóa vùng cụ thể của DNA bởi methyl hóa HpaII bảo vệ DNA chống lại phân hủy bởi endonuclease HpaII giới hạn trình tự tương đồng tetrameric CCGG [1888]. Tuy nhiên, hoạt động của enzyme giới hạn endonuclease MspI, một isoschizomer của HpaII, không bị ảnh hưởng bởi dư lượng methyl hóa CCGG với methyl hóa HpaII vì MspI chỉ nhạy cảm với methyl hóa của dư lượng cytosine bên ngoài [1889], [1890]. Ngoài ra, hoạt động của SmaI giới hạn endonuclease có vị trí nhận
biết CCCGGG là một tập hợp các điểm HpaII, cũng bị ức chế bởi methyl hóa dư lượng cytosine bên trong với methyl hóa HpaII. Ngược lại, hoạt động của XmaI methyl hóa.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Enzymes in Industry Production and Applications _Edited by Wolfgang Aehle _Third, Completely Revised Edition. [2] Thuật ngữ sinh học Anh – Việt_Mai Đình Yên, Vũ Văn Vụ, Đình Lương_Hà Nội – 2006.