Mục đích thí nghiệm: Nghiên cứu hoá chất, nồng độ thời gian thích hợp cho khử trùng cành mắt ghép cây có múi.
Thu thập mỗi mẫu giống 5 cây, các cây thu thập mẫu sẽ được kiểm tra 2 bệnh chính gây hại trên cây có múi là bệnh Tristeza và Huanglongbinh.
Các cành thu thập được bọc trong giấy bản và để trong túi nilon sẽđược rửa sạch bằng xà phòng sau đó cắt rời từng đoạn cành có chứa mắt ngủ với chiều dài từ
5-7 cm và được khử trùng đưa vào môi trường ống nghiệm.
+ Phương pháp duy trì mẫu thu thập tại vườn nhân giống cây triển vọng trong điều kiện nhà lưới.
Các mẫu thí nghiệm sẽ được khử trùng với 3 hoá chất khử trùng là H2O2, Javel, HgCl2. Theo dõi ảnh hưởng của hoá chất và thời gian khử trùng lên tỷ lệ
sống, tỷ lệ chết và tỷ lệ nhiễm của mẫu thí nghiệm. Mỗi công thức thí nghiệm ít nhất 30 mẫu.
2.3.2. Thí nghiệm xác định môi trường phù hợp tạo chồi in vitro
Thí nghiệm được tiến hành nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung chất
điều hòa sinh trưởng.
Môi trường cơ bản (MS):Muối đa lượng, vi lượng, vitamin, axit amin theo Murashige and Skoog (Murashige and Skoog, 1962).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng: NH4NO3, KNO3, KH2PO4, MgSO4.7H2O, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, Na2MoO4.2H2O, KI, CoCl2.6H2O, FeSO4.7H2O, Na2EDTA.2H2O.
- Các Vitamin: Nicotine acid, Thiamine.HCl, Pyrydoxine.HCl. - Aminoacid: Glycine.
- Chất hữu cơ bổ sung: Nước dừa.
- Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: Agar. - Chất điều hoà sinh trưởng: BAP.
- Nguồn cacbon: Đường sacharoza.
Mục đích thí nghiệm: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên sự bật chồi, thời gian bật chồi của mẫu nuôi cấy.
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đối với sự bật chồi của mẫu cành sau khi khử trùng cắt thành từng đoạn có chồi nách và được nuôi cấy trên môi trường ống nghiệm với 6 công thức thí nghiệm và 3 lần lặp lại mỗi công thức thí nghiệm 3 bình:
- Công thức 1:
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 0 mg BAP/l - Công thức 2:
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l+ 0,5 mg BAP/l - Công thức 3:
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 1 mg BAP/l - Công thức 4:
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 2 mg BAP/l - Công thức 5:
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 3 mg BAP/l - Công thức 6:
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l 5 mg BAP/l + Điều kiện nuôi cấy:
Phòng nuôi cấy: nhiệt độ phòng 25oC -27oC, cường độ ánh sáng 2400- 3000lux, độẩm < 70% .
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
Thời gian chiếu sáng: 8h - 12h/24h.
Các dụng cụ buồng cấy được khử trùng bằng cồn và nhiệt.
Độ pH của môi trường: 5,6 – 5,8
+ Các chỉ tiêu theo dõi: Số chồi trên đoạn cành và chiều dài chồi (mm)
2.3.3 Thí nghiệm tìm hiểu môi trường phù hợp tái sinh cây
Thí nghiệm được tiến hành nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung chất
điều hòa sinh trưởng.
Môi trường cơ bản (MS):Muối đa lượng, vi lượng, vitamin, axit amin theo Murashige and Skoog (Murashige and Skoog, 1962).
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ NAA kết hợp với BAP thích hợp trong môi trường nuôi cấy in vitro cho tạo cây hoàn chỉnh của các giống cây có múi khác nhau và ảnh hưởng của các kiểu gen khác nhau đối với tạo chồi in vitro.
Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ NAA kết hợp với BAP phát triển chồi và ra rễ của các kiểu gen cây có múi khác nhau trong nuôi cấy in vitro, các mẫu mắt ngủ sau khi bật chồi trên môi trường tạo chồi sẽ được cấy chuyển sang bình môi trường nuôi cấy với 6 công thức thí nghiệm và 3 lần lặp lại mỗi công thức thí nghiệm 3 bình:
- Công thức 1: Được xác định trên thí nghiệm 3.3.2
MS + 30g đường Sacharosse/l + 6g Agar/l + 0 mg NAA/l+ BAP - Công thức 2: Được xác định trên thí nghiệm 3.3.2
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l +0,5 mg/l NAA+ BAP - Công thức 3: Được xác định trên thí nghiệm 3.3.2
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 1 mg NAA/l + BAP - Công thức 4: Được xác định trên thí nghiệm 3.3.2
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 2mg NAA/l+ BAP - Công thức 5: Được xác định trên thí nghiệm 3.3.2
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l +3mg NAA/l+ BAP - Công thức 6: Được xác định trên thí nghiệm 3.3.2
MS + 30g đường Sacharose/l + 6g Agar/l +5mg NAA/l+ BAP
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
Phòng nuôi cấy: nhiệt độ phòng 25oC -27oC, cường độ ánh sáng 2400- 3000lux, độẩm < 70% .
Thời gian chiếu sáng: 8h - 12h/24h.
Các dụng cụ buồng cấy được khử trùng bằng cồn và nhiệt.
Độ pH của môi trường: 5,6 – 5,8
+ Các chỉ tiêu theo dõi : Tỷ lệ kéo dài chồi và tỷ lệ ra rễ
2.3.4 Xác định điều kiện nuôi cấy và chất làm chậm sinh trưởng phù hợp đưa vào
bảo tồn
Mục đích thí nghiệm:
- Xác định được điều kiện nuôi cấy và chất làm chậm quá trình sinh trưởng mẫu bảo tồn.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng và nhiệt độđến các kiểu gen. - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của các chất sắt 138 và ABA làm chậm quá trình sinh trưởng của chồi trên các kiểu gen giữa các khoảng thời gian cấy chuyển.
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng bảo tồn In vitro. Nhiệt độ thấp kết hợp với cường độ ánh sáng yếu hoặc tối để hạn chế sinh trưởng (Withers và Engelmann, 1997).
Mục đích thí nghiệm: Xác định được điều kiên nuôi cấy bảo tồn gen sau khi tái sinh cây hoàn chỉnh trên công thức môi trường tối ưu nhất.
Ánh sáng được duy trì bình thường trong phòng nuôi cấy là: 2400-3000lux. Nhiệt độđược duy trì bình thường trong phòng nuôi cấy 25oC - 27oC. - Công thức 1:
Ánh sáng bình thường + nhiệt độ binh thường - Công thức 2: Ánh sáng bình thường + nhiệt độ 15oC - Công thức 3: Trong tối + nhiệt độ 15oC - Công thức 4: Trong tối + nhiệt độ 10oC - Công thức 5: Trong tối + nhiệt độ 5oC
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ cây sống và số cây trung bình sống/bình
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sắt 138 đến khả năng chậm sinh trưởng trong báo tồn.
Môi trường cơ bản (MS):Muối đa lượng, vi lượng, vitamin, axit amin theo Murashige and Skoog (Murashige and Skoog, 1962).
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng: NH4NO3, KNO3, KH2PO4, MgSO4.7H2O, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, Na2MoO4.2H2O, KI, CoCl2.6H2O, FeSO4.7H2O, Na2EDTA.2H2O.
- Các Vitamin: Nicotine acid, Thiamine.HCl, Pyrydoxine.HCl. - Aminoacid: Glycine.
- Chất hữu cơ bổ sung: Nước dừa.
- Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: Agar. - Nguồn cacbon: Đường sacharoza.
Làm chậm sinh trưởng bằng cải tiến môi trường nuôi cấy, Giảm hàm lượng
đường và các nguyên tố vi lượng hoặc dầu vi lượng (Withers và Engelmann, 1997). Thí nghiệm được tiến hành nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS + sắt 138; - Công Thức 1:
1/2 MS + 10g đường Sacharose/lít + 6g Agar/lít + 0 mg sắt 138/l; - Công Thức 2:
1/2 MS + 10g đường Sacharose/lít + 6g Agar/lít + 100 mg sắt 138/l; - Công Thức 3:
1/2 MS + 10g đường Sacharose/lít + 6g Agar/lít + 200 mg sắt 138/l; - Công Thức 4:
1/2 MS + 10g đường sacharose/lít + 6g Agar/lít + 300 mg sắt 138/l; - Công Thức 5:
1/2 MS + 10g đường Sacharose/lít + 6g Agar/lít + 400 mg sắt 138/l; - Công Thức 6:
1/2 MS + 10g đường sacharose/lít + 6g Agar/lít + 500 mg sắt 138/l.
- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ cây sống, chiều cao cây, số lá trung bình của cây và số rễ trung bình của cây.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của ABA đến khả năng làm chậm sinh trưởng trong bảo tồn in vitro.
Thí nghiệm được tiến hành nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS + ABA; - Công Thức 1:
1/2 MS + 10g đường sacharose/lít + 6g Agar/lít + 0 ppm ABA; - Công Thức 2:
1/2 MS + 10g đường sacharose/lít + 6g Agar/lít + 20ppm ABA; - Công Thức 3:
1/2 MS + 10g đường Sacharose/lít + 6g Agar/lít + 40ppm ABA; - Công Thức 4:
1/2 MS + 10g đường Sacharose/lít + 6g Agar/lít + 50 ppm ABA; - Công Thức 5:
1/2 MS + 10g đường Sacharose/lít + 6g Agar/lít + 60ppm ABA; - Công Thức 6:
1/2 MS + 10g đường sacharose/lít + 6g Agar/lít + 70 ppm ABA.
- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ cây sống, chiều cao trung bình của cây, số lá trung bình của cây, số rễ trung bình của cây
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập khử trùng vật liệu nuôi cấy Invitro
Trong nuôi cấy mô nói chung và bảo tồn nguồn gen invitro nói chung, khử
trùng tạo nguồn vật liệu ban đầu sạch đưa vào trong ống nghiệm là khâu vô cùng quan trọng, quyết định đến sự thành công của cả quá trình. Trong đó việc xác định
được loại chất khử trùng và thời gian khử trùng thích hợp cho từng loại mẫu giúp cho việc đưa mẫu vào được thuận lợi hơn, tiết kiệm thời gian, chi phí và lượng mẫu ban đầu. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên 3 loại hóa chất là H202, JAVEN và HgCl2 ở những nồng độ và thời gian khác nhau, tuy nhiên chỉ với nồng độ H202 15% trong 10 phút, JAVEN 5% trong 10 phút và HgCl2 0.1% trong 10 phút các thí nghiệm mới cho kết quả khả quan, những nồng độ còn lại gây ra hiện tượng cây chết hoặc nhiễm rất nhiều, tỷ lệ cây sống rất thấp. Bảng 3.1 là tỷ lệ cây sống ở
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 Bảng 3.1. Xác định chất khử trùng và thời gian khử trùng ĐVT: % Kí hiệu giống H202 15%,10 ph JAVEN 5%, 10 ph HgCl2 0.1%, 10 ph Mẫu sống Mẫu sống Mẫu sống G1 23,3 33,5 60,1 G2 37,9 38,7 57,8 G3 40,1 26,2 62,7 G4 30,7 25,6 77,1 G5 50,3 22,3 53,4 G6 43,5 73,4 56,8 G7 37,9 67,3 62,1 G8 43,2 70,1 68,4 G9 47,1 57,0 44,9 G10 20,4 63,4 51,7 G11 12,1 24,7 56,4 G12 37,9 37,3 61,5 G13 27,5 36,7 52,0 G14 37,0 16,5 49,9 G15 57,4 23,8 74,2 G16 23,1 19,6 70,6 G17 17,6 27,3 61,0 G18 13,8 32,5 58,6 G19 66,5 23,4 48,7 G20 36,7 25,1 64,8 TB 35,2 37,22 59,64
Từ bảng 3.1 cho thấy, khi sử dụng các chất khử trùng khác nhau cho tỷ lệ
cây sống khác nhau ở mỗi nhóm cây.
Khi khử trùng bằng H2O215% trong 10 phút với các loại giống, nhận thấy tỷ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
- Nhóm giống cam: Trong 5 mẫu cam thì mẫu G5 có tỷ lệ sống cao nhất đạt 50,3% mẫu G1 có tỷ lệ sống thấp nhất đạt 23,3%. Tỷ lệ sống trung bình của giống cam đạt 36,46%.
- Nhóm giống quýt: Tỷ lệ sống trung bình của giống quýt cao hơn giống cam
đạt 38,42%, trong đó mẫu G9 có tỷ lệ sống cao nhất đạt 47,1% và mẫu G10 có tỷ lệ
sống thấp nhất đạt 20,4%.
- Nhóm giống bưởi: Trong 5 mẫu bưởi thì mẫu G15 có tỷ lệ sống cao nhất, có thể đạt tới 57,4% mẫu G11 là mẫu có tỷ lệ sống thấp nhất, chỉ đạt 12,1%. Tỷ
lệ sống trung bình của giống bưởi là 34,38 thấp hơn so với các mẫu giống cam, giống quýt.
- Nhóm các giống khác: Tỷ lệ sống trung bình của các giống khác là 31,54% thấp nhất trong các mẫu thí nghiệm. Trong đó mẫu G18 có tỷ lệ sống thấp nhất, chỉ đạt 13,8% mẫu G19 có tỷ lệ sống cao nhất đạt 66,5% đây cũng là mẫu có tỷ lệ sống cao nhất so với 20 mẫu được thí nghiệm.
Khi khử trùng bằng nước Javen 5% trong 10 phút có kết quả như sau: Tỷ lệ
sống trung bình của 20 mẫu là 37,22%. Cụ thể
- Nhóm giống cam: Với 5 mẫu được thí nghiệm thì mẫu G2 có tỷ lệ sống cao nhất đạt 38,7%, mẫu G5 có tỷ lệ sống thấp nhất chỉ đạt 22,3%. Tỷ lệ sống trung bình của giống cam khi khử trùng bằng nước Javen 5% đạt 29,26%.
- Nhóm giống quýt: Tỷ lệ sống trung bình của 5 mẫu giống quýt khi khử
trùng bằng nước Javen 5% trong 10 phút đạt 66,24%. Trong đó mẫu G6 có tỷ lệ
sống cao nhất đạt 73,4% đây cũng là mẫu có tỷ lệ sống cao nhất trong 20 mẫu thí nghiệm. Mẫu số G9 là mẫu có tỷ lệ sống thấp nhất đạt 57%.
- Nhóm giống bưởi: Trong 5 mẫu giống bưởi được khử trùng bằng nước Javen 5% trong 10 phút thì mẫu số G13 là mẫu có tỷ lệ sống cao nhất, đạt 36,7% mẫu số G14 là mẫu có tỷ lệ sống thấp nhất chỉđạt 16,5%, đây cũng là mẫu có tỷ lệ
sống thấp nhất trong 20 mẫu giống thí nghiệm. Tỷ lệ sống trung bình của nhóm giống bưởi là 27,8%.
- Nhóm giống khác: Tỷ lệ sống trung bình của nhóm giống khác là 25,58%,
đây là nhóm có tỷ lệ sống thấp nhất trong 4 nhóm giống được thí nghiệm. Trong đó mẫu G16 là mẫu có tỷ lệ sống thấp nhất, chỉđạt 19,6% và mẫu G18 là mẫu có tỷ lệ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38
Khi khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút đối với 20 mẫu giống thì tỷ lệ sống trung bình của các mẫu là 59,64%. Đây là dung dịch khử trùng có tỷ lệ sống của các mẫu thí nghiệm cao nhất trong 3 dung dịch.
- Nhóm giống cam: Tỷ lệ sống trung bình của nhóm mẫu này là 62,22% đây là nhóm giống có tỷ lệ sống cao nhất trong 4 nhóm giống được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1%. Trong đó mẫu G5 là mẫu có tỷ lệ sống thấp nhất chỉđạt 53,4% và mẫu G4 là mẫu có tỷ lệ sống cao nhất đạt 77,1%. Mẫu G4 cũng là mẫu có tỷ lệ sống cao nhất trong 20 mẫu được thí nghiệm.
- Nhóm giống quýt: Mẫu có tỷ lệ sống thấp nhất là mẫu G9 với 44,9% sống trong 30 mẫu được thí nghiệm, mẫu có tỷ lệ sống cao nhất là mẫu G8 với 68,4%. Tỷ
lệ sống trung bình của nhóm giống quýt là 56,78%. Đây là nhóm có tỷ lệ sống trung bình thấp nhất trong 4 nhóm được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1%.
- Nhóm giống bưởi: Tỷ lệ sống trung bình của giống bưởi là 58,8%. Trong
đó mẫu có tỷ lệ sống cao nhất nhóm là G15 với 74,2% mẫu có tỷ lệ sống thấp nhất nhóm là mẫu G14 với 49,9%.
- Nhóm giống khác: Mẫu có tỷ lệ sống thấp nhất là mẫu G19 chỉ đạt 48,7%, mẫu có tỷ lệ sống cao nhất là mẫu G16 với 70,6%. Tỷ lệ sống trung bình của các mẫu giống khác là 60,74%.
Ở nhóm các giống cam khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút cho tỷ lệ
cây sống đạt cao hơn khi khử trùng bằng Javen hay nước oxy già, chỉ duy nhất ở