Hòa tan 1g quercetin trong acetone. Sau đó cho 1 g sodium acetate và 3 ml anhydride acetic vào bình cầu 2 cổ, khuấy bằng cá từ và đun hồi lưu hỗn hợp 5h . Lấy toàn bộ hỗn hợp này cho vào cốc nước đá đang khuấy bằng cá từ, để yên đợi kết tủa lắng xuống rồi, lọc rửa lại nhiều lần với nước lạnh ta thu được sản phẩm thô. Sấy khô sản phẩm để chuẩn bị làm sạch.
Sơ đồ khối:
Acetone
(CH3COO)2O / CH3COONa 5h, khuấy, nhiệt độ
Nước đá khuấy
Nước lạnh
Sơ đồ tổng hợp quercetin pentaacetate 1g Quercetin Sấy khô Lọc Lắng Làm lạnh nhanh Ester hóa Hòa tan Sản phẩm thô
Làm sạch
Hòa tan quercetin pentaacetate thô với acetone, đun sôi khấy nhẹ bằng cá từ cho đến khi hòa tan hoàn toàn, lọc nóng dung dịch. Sau đó chờ dung dịch nguội rồi cho vào tủ lạnh để kết tinh, khi xuất hiện kết tủa trắng lọc lấy kết tủa rồi sấy thu được sản phẩm tinh.
Sơ đồ khối:
Acetone
Acetone lạnh
Sơ đồ tinh chế quercetin pentaacetate Quercetin pentaacetate thô
Quercetin pentaacetate tinh Sấy khô
Lọc Làm lạnh Lọc nóng Hòa tan
CHƯƠNG 3. ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU 1 Quy trình thực nghiệm
Theo các nghiên cứu gần đây nhất, người ta đã tổng hợp được Quercetin và Luteolin bằng nhiều phương pháp khác nhau, sau khi tham khảo sơ bộ một số tài liệu đã nghiên cứu kết hợp với điều kiện thực nghiệm sẵn có, chúng tôi đã chọn quy trình tổng hợp như sau:
Từ Quercetin và Luteolin có sẵn trong PTN chúng tôi sẽ tổng hợp 2 dẫn xuất mới từ Quercetin và 2 dẫn xuất mới từ Luteolin
2 Phương tiện nghiên cứu
1 Thiết bị
- Cân điện tử Mettler Toledo Ab204, Sartorius GP 1503 P.
- Máy UV 2450 Shimadzu tại Viện Công nghệ Hóa học Việt Nam. - Tủ sấy thường, cân thường và cân vi lượng.
- Máy đo điểm chảy ELECTRONTHERMAL 9000 tại phòng Phòng Y sinh, Viện Khoa học Vật liệuứng dụng.
- Máy quang phổ hồng ngoại IR-Vector 22 Bruker của Viện Công nghệ Hóa học.
- Hệ thống Sắc ký lỏng cao áp LC 1090 Hewlett Parkard ghép khối phổ của hãng MSD-Trap 1100 Agilent.
- Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC 200, tần số 500 MHz tại Viện Hóa học.
2 Dụng cụ
- Bình tam giác loại 50 mL, 100 mL, 250 mL. - Becher loại 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL.
- Bản mỏng loại 25DC-Alufolien 20x20 cm, Kiesegel 60 F254, Merk.
- Ống hút, pipet, đũa thủy tinh, cá từ, lọ thủy tinh, chai đựng mẫu, ống mao quản, mặt kính đồng hồ, ống đong 50 mL, 25 mL.
- Bình định mức 100 mL, 500 mL.
3 Phương pháp phân tích và xác định hoạt tính sinh học của sản phẩm
1 Các phương pháp phân tích sản phẩm
Phương pháp sắc ký bản mỏng, đo điểm chảy, phổ UV, phổ IR, phổ LC-MS, phổ NMR xác định cấu trúc các dẫn xuất thu được
2 Xác định hoạt tính gây độc tế bào
Trong tương lai chúng sẽ tiến hành các thí nghiệm tổng hợp các dẫn suất của Quercetin và Luteolin bằng cách gắn các nhóm chức có chứa N lên các phân tử
Quercetin và Luteolin, sau đó sẽ tiến hành thử nhiệm xác định hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất làm được. phương pháp được đề xuất để xác định hoạt tính là phương pháp SRB (thực hiện tại Phòng Thí nghệm Sinh học phân tử- Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia TP.HCM)
Nguyên tắc: sử dụng phương pháp Sulforhodamin B (SRB) là một phương pháp nhuộm màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào.
Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu đối chứng phản ánh độc tính tế bào của chất thử.
THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO
- Giải đông nguồn tế bào ung thư bảo quản trong nitơ lỏng và nuôi cấy tế bào đến thế hệ thứ 4 (P4).
- Nuôi tế bào trong bình nuôi cấy đạt độ phủ khoảng 70 - 80%.
- Phủ tế bào vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ tế bào/giếng ban đầu là 104 tế bào/giếng (đối với dòng tế bào HeLa và MCF-7) và 7,5.103 tế bào/giếng (đối với dòng NCI-H460) theo thiết kế (*)
- Ủ ở 37oC, 5% CO2, 24 giờ.
- Bổ sung môi trường chứa chất thử với nồng độ gấp đôi nồng độ muốn thử (chú ý: không loại bỏ môi trường cũ đã có ở trong giếng).
Đối với những dòng tế bào bám dính: sử dụng dung dịch TCA 50% lạnh vào mỗi giếng (cho vào từ từ không quá nhanh).
Đối với những dòng tế bào lơ lửng: sử dụng dung dịch TCA 80% lạnh vào mỗi giếng. Đặt đĩa trên vào trong tủ lạnh (4oC), 1-3 giờ, sau đó loại bỏ chất lỏng trong mỗi giếng, rửa nhẹ nhàng với nước (200 µl/giếng) 5 lần và để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, 12-24 giờ.
- Nhuộm SRB:
Cho dung dịch SRB 0,2% vào mỗi giếng.
Ủ ở nhiệt độ phòng, 5-20 phút.
Loại bỏ dung dịch SRB.
Rửa nhẹ nhàng bằng dung dịch axit axetic 1% (5 lần)
Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 12-24 giờ.
- Đọc kết quả:
Cho 200 µl Tris-base 10mM vào mỗi giếng.
Đặt lên máy lắc khoảng 10-15 phút cho đến khi SRB tan hoàn toàn. Đo mật độ quang ở bước sóng 492nm và 620nm trên máy Elisa reader. (*)Thiết kế khảo sát, gồm:
- 1 mẫu chứng dương: tế bào với camptothecin ở nồng độ 0,01(µg/ml).
- 1 mẫu chứng âm : tế bào với dung môi hòa tan chất thử (DMSO 0,25%)
- Các mẫu cần thử nghiệm hoạt tính gây độc ở nồng độ khảo sát.
- Thiết kế thử nghiệm của 1 mẫu, gồm:
3 giếng tế bào + môi trường nuôi cấy có chứa chất thử ở nồng độ khảo sát.
1 giếng không có tế bào + môi trường nuôi cấy có chứa chất thử ở nồng độ khảo sát (1 giếng trắng).
Xử lý kết quả:
- Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm và 620 nm (ký hiệu là OD492 và OD620)
- Tính giá trị OD = OD492 - OD620 (1)
- Tính phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào theo công thức: % 100 ) 1 ( % = − × OD OD C TN I
Với: - ODtb: giá trị OD của giếng có chứa tế bào - ODtrắng: giá trị OD của giếng trắng
- ODTN: giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2)
- ODC: giá trị OD của mẫu chứng (control) tính từ công thức (1) và (2)
Giá trị IC50 được xác định như sau: Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ cho tỉ lệ gây độc tế bào 50% bằng cách:
o Tính phương trình đường thẳng qua 2 điểm có tỉ lệ gây độc tế bào gần 50% nhất (1 điểm có tỉ lệ gây độc tế bào nhỏ hơn 50%, điểm còn lại có tỉ lệ gây độc tế bào lớn hơn 50%).
o Từ phương trình trên (có dạng y = ax + b), thế y = 50 vào, ta suy ra được giá trị nồng độ x chính là IC50.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, 1985, Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc,Nhà xuất bản Y học
[2]. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản ĐHQG Tp Hồ Chí Minh
[3]. Nguyễn Ngọc Hạnh, 2002, Tách chiết và cô lập hợp chất tự nhiên, Giáo trình cao học [4]. Dược điển Việt Nam III, 2002, NXB Y học
[5]. Đỗ Tất Lợi, 2001, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học
[6]. T.A. Geissman, The Chemistry of Flavonoid Compounds, Pergamon Press Oxford-London-New York-Paris, 1962.
[7]. Ververidis Filippos, F; Trantas Emmanouil, Douglas Carl, Vollmer Guenter, Kretzschmar Georg, Panopoulos Nickolas (October 2007). "Biotechnology of flavonoids and other phenylpropanoid -derived natural products
[8]. Cushnie TPT, Lamb AJ (2005). "Antimicrobial activity of flavonoids ". International Journal of Antimicrobial Agents 26 (5): 343 –356.
[9]. Richard Mayer, Possible Cancer-fighting Properties Found in Certain Bioflavonoids, U.S. Horticultural Research Laboratory, August 9, 2000.
[10]. Nguyễn Hương Thảo, Võ Văn Lẹo, Ngô Thu Vân, Trần Hùng, 2001, Khảo sát Flavonoid từ vỏ quit, tạp chí dược học – số 5.
[11]. J. B. Harborne, T. J. Mabry. The flavonoids: Advances in Research, London NewYork Chapman and Hall, 1984.
[12]. Wu LL, Yang XB, Huang ZM, Liu HZ, Wu GX. In vivo and in vitro antiviral activity of hyperoside extracted from Abelmoschus manihot (L) medik. Research Center for Eco- Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
[13]. Yu YB, Miyashiro H, Nakamura N, Hattori M, Park JC. Effects of triterpenoids and flavonoids isolated from Alnus firma on HIV-1 viral enzymes. Department of Herbal Pharmaceutical Development, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 305-811, Korea
[14]. Neuhouser ML (2004). "Dietary flavonoids and cancer risk: evidence from human population studies". Nutr Cancer 50 (1): 1–7
[15]. Murakami A, Ashida H, Terao J (October 2008). "Multitargeted cancer prevention by quercetin". Cancer Lett. 269 (2): 315–25
[16]. Nöthlings U et al. (2007). "Flavonols and pancreatic cancer risk". American Journal
of Epidemiology 166 (8): 924–931
[17]. Paliwal S; Sundaram, J; Mitragotri, S (2005). "Induction of cancer-specific cytotoxicity towards human prostate and skin cells using quercetin and ultrasound". British Journal of Cancer 92 (3): 499–502.
[18]. Xavier, Cristina; Lima, Cristovao; Rohde, Mikkel; Pereira-Wilson, Cristina (2011-04- 10). "Quercetin enhances 5-fluorouracil-induced apoptosis in MSI colorectal cancer cells through p53 modulation". Cancer Chemotherapy and Pharmacology (0344-5704)
[19]. Peter C.H Hollman, John M.P van Trijp, Michel N.C.P Buysman, Martijn S v.d. Gaag, Marcel J.B Mengelers, Jeanne H.M de Vries, Martijn B Katan “Relative bioavailability of the antioxidant flavonoid quercetin from various foods in man” FEBS Letters, Volume 418, Issue 1, Pages 152-156
[20]. Laura K. Stewart, Jeff L. Soileau, David Ribnicky, Zhong Q. Wang, Ilya Raskin, Alexander Poulev, Martin Majewski, William T. Cefalu, and Thomas W. Gettys (2008). "Quercetin transiently increases energy expenditure but persistently decreases circulating markers of inflammation in C57BL/6J mice fed a high-fat diet". Metabolism 57.
[21]. J. Mark Davis, E. Angela Murphy, Martin D. Carmichael, and Ben Davis (2009), "Quercetin increases brain and muscle mitochondrial biogenesis and exercise tolerance", Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 296
[22]. Balabolkin, II; Gordeeva, GF; Fuseva, ED; Dzhunelov, AB; Kalugina, OL; Khamidova, MM (1992). "Use of vitamins in allergic illnesses in children". Voprosy meditsinskoi khimii
38 (5): 36–40.
[23]. Lucas HJ, Brauch CM, Settas L, Theoharides TC (2006). "Fibromyalgia--new concepts of pathogenesis and treatment". Int J Immunopathol Pharmacol 19 (1): 5–10.
[24]. Edwards RL, Lyon T, Litwin SE, Rabovsky A, Symons JD, Jalili T (1 November 2007). "Quercetin reduces blood pressure in hypertensive subjects". J. Nutr. 137 (11): 2405–11. [25]. Egert S et al. (2009). "Quercetin reduces systolic blood pressure and plasma oxidised low-density lipoprotein concentrations in overweight subjects with a high-cardiovascular disease risk phenotype: A double-blinded, placebo-controlled cross-over study". Br J Nutr
102 (7): 1065–1074.
[26]. Chowdhury, A.R. Sharma, S. Mandal, S. Goswami, A. Mukhopadhyay, S. Majumder,
H.K. Luteolin, an emerging anti−cancer flavonoid, poisons eukaryotic DNA topoisomerase I. Biochem. J, 2002.
[27]. Bagli, E. Stefaniotou, M. Morbidelli, L. Ziche, M. Psillas, K. Murphy, C. Fotsis, T. Cancer
Res, Luteolin inhibits vascular endothelial growth factor−induced angiogenesis; inhibition of endothelial cell survival and proliferation by targeting phosphatidylinositol 3′− kinase activity, 2004.
[28]. Kim, J.H. Jin, Y.R. Park, B.S. Kim, T.J. Kim, S.Y. Lim, Y. Hong, J.T. Yoo, H.S. Yun, Y.P., Luteolin prevents PDGF−BB−induced proliferation of vascular smooth muscle cells by inhibition of PDGF beta−receptor phosphorylation, 2005. Biochem. Pharmacol
[30]. Yuan-Li Li, Guo-Ping Gan, Hui-Zhan Zhang, He Zhen Wu,Chang-Long Li, Yong- Ping Huang, Yan-Wen Liu, Jian-Wen Liu A flavonoid glycoside isolated from Smilax china L. rhizome in vitro anticancer effects on human cancer cell lines, Journal of Ethnopharmacology
[31]. GIUSEPPE GALATI and PETER J. O’BRIEN, POTENTIAL TOXICITY OF FLAVONOIDS AND OTHER DIETARY PHENOLICS: SIGNIFICANCE FOR THEIR CHEMOPREVENTIVE AND ANTICANCER PROPERTIES, Department of
Pharmacology and Faculty of Pharmacy, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada M5S 2S2
[32]. Sonia Ramos, Effects of dietary flavonoids on apoptotic pathways related to cancer chemoprevention, Journal of Nutritional Biochemistry 18 (2007) 427 – 442
[33]. K. Morley, J. Koropatnick., An investigation of the anticancer
mechanism of citrus flavonoids tangeretin and nobiletin,University of
Western Ontario, London, Canada
[34]. Haisheng Zhang , Min Zhang , Linhong Yu , Yan Zhao , Nianwu He , Xingbin Yang, Antitumor activities of quercetin and quercetin-5’,8- disulfonate in human colon and breast cancer cell lines, Food and Chemical Toxitology
[35]. Jiaqi Yan, Qiong Wang, Xuelian Zheng, Hong Sun, Yuqiong Zhou, Daoxia Li, Yong Lin, Xia Wang, Luteolin enhances TNF-related
apoptosis-inducing ligand’s anticancer activity in a lung cancer xenograft mouse model , Biochemical and Biophysical Research
Communications
[36]. Samir Attoub, Ahmed H. Hassan, Barbara Vanhoecke, Rabah Iratni, Takashi Takahashi, Anne-Marie Gaben, Marc Bracke, Salma Awad, Anne John, Hamda Ahmed Kamalboor, Mahmood Ahmed Al Sultan, Kholoud Arafat, Christian Gespach, Georg Petroianu, Inhibition of cell survival, invasion, tumor growth and histone deacetylase activity by the dietary flavonoid luteolin in human epithelioid cancer cells, European Journal of