nguyên CD47
Khả năng liên kết của kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp thu đƣợc với kháng nguyên CD47 đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang. Do Jurkat là dòng tế bào biểu hiện mạnh CD47 nên dòng tế bào này đƣợc chọn để khảo sát. Sự liên kết liên kết giữa kháng thể anti-CD47 và kháng nguyên CD47 biểu hiện trên bề mặt tế bào Jurkat đƣợc thể hiện trên Hình 3.9.
31
Hình 3.9. Khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên CD47 biểu hiện trên bề mặt tế bào Jurkat. (A). Hình ảnh tế bào Jurkat sau khi ủ với kháng thể anti-CD47-GFP đƣợc quan sát dƣới ánh sáng trắng của kính hiển vi huỳnh quang, (B). Hình ảnh tế bào Jurkat sau khi ủ với kháng thể anti-CD47-GFP đƣợc quan sát dƣới ánh sáng có bƣớc sóng kích thƣớc 465 nm của kính hiển vi huỳnh quang, (C) Hình ảnh tế bào Jurkat sau khi ủ với kháng thể anti-CD47 sau đó ủ tiếp với kháng thể anti-CD47-GFP đƣợc
quan sát dƣới ánh sáng trắng của kính hiển vi huỳnh quang, (D). Hình ảnh tế bào Jurkat sau khi ủ với kháng thể anti-CD47 sau đó ủ tiếp với kháng thể anti-CD47-GFP đƣợc quan
sát dƣới ánh sáng có bƣớc sóng kích thƣớc 465 nm của kính hiển vi huỳnh quang.
Kết quả thu đƣợc trên Hình 3.9 cho thấy, mẫu 1 (Hình 3.9 B) có tín hiệu huỳnh quang rất mạnh thể hiện tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên CD47 và kháng thể anti-CD47-GFP. Mẫu 2 (Hình 3.9 D) có tín hiệu huỳnh quang rất yếu chứng tỏ rằng kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp đã liên kết đƣợc với kháng nguyên CD47 trên bề mặt tế bào Jurkat trƣớc khiến cho kháng thể anti-CD47-GFP hầu nhƣ
32
không còn vị trí để liên kết với kháng nguyên CD47. Kết quả này cho thấy kháng thể tái tổ hợp anti-CD47 mà chúng tôi thu đƣợc có khả năng liên kết đặc hiệu với CD47 biểu hiện trên bề mặt tế bào Jurkat.
Miễn dịch huỳnh quang là phƣơng pháp nhận diện đích dựa trên tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể cho kết quả khách quan, chính xác và đƣợc coi là một xét nghiệm tiêu chuẩn phát hiện sự biểu hiện của kháng nguyên trên bề mặt tế bào với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Do đó, kết quả miễn dịch huỳnh quang cho thấy kháng thể tái tổ hợp anti-CD47 dạng scFv đƣợc tạo ra trong nghiên cứu này có độ đặc hiệu với kháng nguyên CD47 và có tiềm năng ứng dụng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh ung thƣ máu.
33
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu đƣợc trong công trình nghiên cứu này, chúng tôi đƣa ra một số kết luận sau:
1. Đã đƣa gen mã hóa kháng thể antiCD47 có kích thƣớc khoảng 900 bp vào vector biểu hiện pET-22b+.
2. Đã tạo ra đƣợc chủng biểu hiện BL21 (DE3) có khả năng biểu hiện kháng thể tái tổ hợp antiCD47 kích thuớc 39 kDa trên điện di SDS – PAGE và xác định đuợc một số điều kiện thích hợp để biểu hiện protein tái tổ hợp scFv antiCD47 là: nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM; nhiệt độ nuôi cấy là 37oC và thu mẫu sau 3 giờ cảm ứng.
3. Đã buớc đầu tinh sạch thành công protein tái tổ hợp scFv antiCD47 và bƣớc đầu thử nghiệm tƣơng tác đặc hiệu với kháng nguyên đích CD47 trên dòng tế bào Jurkat bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang.
KIẾN NGHỊ
Dựa vào các kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu này, tôi mong muốn tiến hành thêm các nghiên cứu:
1. Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện và tinh sạch kháng thể anti-CD47 ở quy mô lớn. 2. Thử nghiệm sâu hơn các hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp thu đƣợc.
34
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt
1. Bộ môn Ung thƣ (2005), Ung thư học đại cương, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội. 2. PGS. TS Nguyễn Bá Đức (2009), Bài giảng ung thư học, Nhà xuất bản Y
học, Hà Nội.
3. Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2012), Kháng thể tái tổ hợp và ứng dụng,
Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội.
4. Lê Đình Sáng (2010), Bệnh học ung thư, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 5. PSG. TS Phạm Văn Ty (2008), Miễn dịch học, Nhà xuất bản giáo dục.
Tài liệu tiếng Anh
6. Huang Y, Ma Y, Gao P, Yao Z(2017). Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy. J Thorac Dis:E168 – E174.
7. JaiswalS,JamiesonCH,PangWW(2009)CD47isupregulatedoncirculating hematopoietic stem cells and le ukemia cells to avoid phagocytosis. Cell; 138:271 – 285.
8. Pang WW(2013), Pluvinage JV, Price EA, et al Hematopoietic stem cell and progenitor cell mechanisms in myelodysplastic syndromes. Proc Natl Acad Sci USA; 110:3011 – 3016.
9. Chao MP (2011), Alizadeh AA, Tang C, Jan M, Weissman-Tsukamoto R, Zhao F, Park CY, Weissman IL, Majeti R. Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res;71 (4):1374–1384. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10.Chao MP, Alizadeh AA, Tang C(2010). Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma. Cell; 142:699–713.
35
11.Chao MP (2012), Weissman IL, Majeti R. The CD47-SIRP alpha pathway in cancer immune evasion and potential therapeutic implications. Curr Opin Immunol. 24:225–232.
12.Willingham SB, Volkmer JP, Gentles AJ, etal.(2012)The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proc Natl Acad Sci U S A; 109:6662–6667.
13.BetancurPA,AbrahamBJ,YiuYY,etal(2017).ACD47-associatedsuper-
enhancer links pro-inflammatory signalling to CD47 upregulation in breast cancer. Nat Commun; 8:14802
14.Wernig G, Chen S-Y, Cui L, et al(2017). Unifying mechanism for different fibrotic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A; 114:4757–4762
15.Kojima Y, Volkmer JP, McKenna K, et al(2016). CD47 blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature; 536:86 – 90
16.Yoshida K, Tsujimoto H, Matsumura K et al(2015). CD47 is an adverse prognostic factor and a therapeutic target in gastric cancer. Cancer Med.
4(9), 1322–1333 .
17.Liu R, Wei H, Gao P et al(2017). CD47 promotes ovarian cancer progression by inhibiting macrophage phagocytosis. Oncotarget 8(24), 39021–39032 . 18.Li Y, Lu S, Xu Y et al. (2017).Overexpression of CD47 predicts poor
prognosis and promotes cancer cell invasion in high-grade serous ovarian carcinoma. Am. J. Transl. Res. 9(6), 2901–1910
19.Tong, B., & Wang, M. (2018). CD47 is a novel potent immunotherapy target in human malignancies: current studies and future promises. Future
Oncology. doi:10.2217/fon-2018-0035 (bài gốc)
20.Jefferis, R. Recombinant antibody therapeutics(2009): The impact of glycosylation on mechanisms of action. Trends Pharmacol. Sci, 30, 356– 362.
21.Li, F.; Vijayasankaran, N.; Shen, A.; Kiss, R.; Amanullah, A(2010). Cell culture processes for monoclonal antibody production. MAbs, 2, 466–479.
36
22.Striedner, G.; Pfaffenzeller, I.; Markus, L.; Nemecek, S.; Grabherr, R.; Bayer, K. Plasmid-free(2010)T7-based Escherichia coli expression systems. Biotechnol. Bioeng.
23.Mairhofer, J.; Cserjan-Puschmann, M.; Striedner, G.; Nöbauer, K.; Razzazi- Fazeli, E.; Grabherr, R. Marker-free(2010) plasmids for gene therapeutic applications—Lack of antibiotic resistance gene substantially improves the manufacturing process. J. Biotechnol.
24.Sonoda, H.; Kumada, Y.; Katsuda, T.; Yamaji, H(2011) Effects of cytoplasmic and periplasmic chaperones on secretory production of single- chain Fv antibody in Escherichia coli. J. Biosci. Bioeng.
25.Yuan, J.; Zweers, J.C.; Van Dijl, J.M.; Dalbey, R.E.(2010) Protein transport across and into cell membranes in bacteria and archaea. Cell. Mol. Life Sci, 67, 179–199.
26.Levy, R.; Ahluwalia, K.; Bohmann, D.J.; Giang, H.M.; Schwimmer, L.J.; Issafras, H.; Reddy, N.B.; Chan, C.; Horwitz, A.H.; Takeuchi, T.(2013) Enhancement of antibody fragment secretion into the Escherichia coli periplasm by co-expression with the peptidyl prolyl isomerase, FkpA, in the cytoplasm. J. Immunol. Methods
27.Costa S., Almeida A., Castro A., et al. (2014). Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system. Front Microbiol, 5.
28.Jalalirad, R(2013). Production of antibody fragment (Fab)
throughout Escherichia coli fed-batch fermentation process: Changes in titre, location and form of product. Electron. J. Biotechnol.
29.Ecker, D.M.; Jones, S.D.; Levine, H.L. (2015) The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs, 7.
30.Müller, D.; Kontermann, R.E(2014). Bispecific Antibodies. In Handbook of Therapeutic Antibodies, 2nd ed.; Wiley-Blackwell: Hoboken, NJ, USA; ISBN 9783527682423.
37
31.Drake, P.M.; Rabuka, D(2015). An emerging playbook for antibody-drug conjugates: Lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr. Opin. Chem. Biol, 28, 174–180.
32.Nelson(2010), A.L. Antibody fragments: Hope and hype. MAbs, 2, 77–83. 33.Fernandes,J.C(2018). Therapeutic application of antibody fragments in (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
autoimmune diseases: Current state and prospects. Drug Discov. Today, 23, 1996–2002.
34.Kholodenko, R.V.; Kalinovsky, D.V.; Doronin, I.I.; Ponomarev, E.D.; Kholodenko, I. V(2017)Antibody Fragments as Potential Biopharmaceuticals for Cancer Therapy: Success and Limitations. Curr. Med. Chem..
35.Bird, R.E.; Hardman, K.D.; Jacobson, J.W.; Johnson, S.; Kaufman, B.M.; Lee, S.M.; Lee, T.; Pope, S.H.; Riordan, G.S.; Whitlow, M.(1988)Single- chain antigen-binding proteins.
36.Huston, J.S.; Levinson, D.; Mudgett-Hunter, M.; Tai, M.S.; Novotný, J.; Margolies, M.N.; Ridge, R.J.; Bruccoleri, R.E.; Haber, E.; Crea, R.(1988) Protein engineering of antibody binding sites: Recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879–5883.
37.Montoliu-Gaya,L.;Esquerda-Canals,G.;Bronsoms,S.;Villegas,S.
(2017)Production of an anti-Aβ antibody fragment in Pichia pastoris and in vitro and in vivo validation of its therapeutic effect. PLoS ONE.
38.Spadiut, O.; Capone, S.; Krainer, F.; Glieder,A.; Herwig,C.(2014) Microbials for the production of monoclonal antibodies and antibody fragments. Trends Biotechnol, 32, 54–60.
39.Yokota, T.; Milenic, D.E.; Whitlow, M.; Schlom, J.(1992) Rapid Tumor Penetration of a Single-Chain Fv and Comparison with Other Immunoglobulin Forms. Cancer Res.
38
40.Li, Z.; Krippendorff, B.F.; Sharma, S.; Walz, A.C.; Lavé, T.; Shah, D.K.(2016) Influence of molecular size on tissue distribution of antibody fragments. Mabs.
41.Cumber, A.J.; Ward, E.S.; Winter, G.; Parnell, G.D.; Wawrzynczak, E.J. (1992)Comparative stabilities in vitro and in vivo of a recombinant mouse antibody FvCys fragment and a bisFvCys conjugate. J. Immunol, 149, 120– 126.
42.Sanz, L.; Cuesta, Á.M.; Compte, M.; Álvarez-Vallina, L.(2005)Antibody engineering: Facing new challenges in cancer therapy. Acta Pharmacol. Sin, 26, 641–648.
43.Jain, A.; Jain, S. PEGylation(2008): An approach for drug delivery. A review. Crit. Rev. Drug Carr. Syst.
44.Müller, D.; Karle, A.; Meißburger, B.; Höfig, I.; Stork, R.; Kontermann, R.E(2007). Improved pharmacokinetics of recombinant bispecific antibody molecules by fusion to human serum albumin. J. Biol. Chem.
45.Poiron, C.; Wu, Y.; Ginestoux, C.; Ehrenmann, F.; Duroux, P.; Lefranc, M. (2008)IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®. Nucleic Acids Res. , 37 (Suppl. S1), D1006–D1012.
46.Brinkmann, U.; Kontermann, R.E.(2017)The making of bispecific antibodies. MAbs , 9, 182–212.
47.Holt, L.J.; Basran, A.; Jones, K.; Chorlton, J.; Jespers, L.S.; Brewis, N.D.; Tomlinson, I.M.(2008) Anti-serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs. Protein Eng. Des. Sel.
39
PHỤ LỤC
1.2. Phụ lục 1
1.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trƣờng Thành phần Nồng độ LB lỏng Peptone 10 g/l Cao nấm men 5 g/l NaCl 10 g/l LB đặc Peptone 10 g/l Cao nấm men 5 g/l NaCl 10 g/l Agar 15 g/l 1.4. Phụ lục 2 Các dung dịch tách plasmid Dung dịch Thành phần Nồng độ Dung dịch I EDTA pH 8.0 Tris HCl pH 8.0 Glucose 10 mM 25 mM 50 mM Dung dịch II SDS NaOH 1% 0.2N Dung dịch III (100 ml) CH3COOK CH3COOH đậm đặc H2O 60 ml 5M 11.5 ml 28.5 ml
40 Thành phần gel Polyacrylamide Gel phân tách Thành phần Thể tích H2O 1,23ml Tris-HCl (3M; pH 8) 0,625ml Acrylamid 2,1 ml Glycerol 50% 1 ml APS 10% 25 l SDS 10% 25 l Temed 4 l Gel cô Thành phần Thể tích H2O 0,85ml Tris-HCl (pH 6,8; 1 M) 156,25µl Acrylamide 212,5µl APS 10% 12,5l SDS 10% 6,25l Temed 1l
Các dung dịch nhuộm, tẩy gel SDS-PAGE
Dung dịch Thành phần Nồng độ
Dung dich nhuộm gel
CBB 0.2% (v/v) Acetic acid 10% (v/v) Methanol 40% (v/v) H2O
Dung dịch tẩy gel
Acetic acid 10% (v/v) Methanol 40% (v/v) H2O
41 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5X Sample (loading) buffer
Thành phần Lượng Nồng độ cuối SDS 1 g 1% Tris (pH 6.8) 0.5 M 25 ml 125 mM Sucrose 15 g 15% β- Mercaptoethanol 10 ml 10% EDTA (pH 7.0) 0.1M 1 ml 1 ml Bromphenol blue 1% 5 ml 0.05% Nước khử ion đến 1 lít Dung dịch đệm PBS 1X, pH 7.0 – 7.3 Thành phần Nồng độ NaCl 9 g/L Na2HPO4 0.975 g/L KH2PO4 0.144 g/L Dung dịch đệm TAE 50X Thành phần Khối lƣợng (thể tích) tính cho 1 L Tris-base 242 g Acid acetic 57.2 mL EDTA 0.5 M, pH 8 100 mL