Hoạt hóa tế bào Jurkat:
Làm ấm môi trƣờng nuôi cấy ở 37oC.
Lấy ống giữ dòng tế bào trong Nitơ lỏng ra và đặt nhanh vào bể ổn nhiệt 37oC đồng thời khuấy nhẹ ống tế bào trong nƣớc để làm rã đông tế bào cho đến khi tế bào tan hoàn toàn (khoảng 1-2 phút).
Hút dịch tế bào vào ống falcon 15 chứa 5 mL môi trƣờng RPMI. Ly tâm tế bào 800 v/ph, 3 phút để loại bỏ DMSO.
Hòa tan nhẹ nhàng tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy rồi hút nhẹ dịch tế bào chuyển vào bình nuôi cấy chuyên dụng T-flask chứa môi trƣờng RPMI1640 bổ sung FBS 10% và kháng sinh PS 0.1%.
Đặt bình nuôi cấy tế bào vào tủ nuôi 37o
C, CO2 5%.
Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi quang học, soi ngƣợc. Khi tế bào phát triển phủ kín khoảng 90% bình (sau khoảng 72 h) thì tiến hành cấy chuyển tế bào sang các bình khác.
20
Cấy chuyển
Mục đích: Tăng sinh tế bào, duy trì tế bào ở trạng thái hoạt động.
Thu dịch tế bào vào ống falcon 15, ly tâm tế bào 800 v/ph, 3 phút để loại bỏ môi trƣờng cũ.
Hòa tan nhẹ nhàng tế bào trong môi trƣờng RPMI mới. Chia dịch huyền phù tế bào sang các bình T-flask mới chứa môi trƣờng RPMI1640 bổ sung FBS 10% và kháng sinh PS 0,1%.
Nuôi tế bào trong tủ ấm ở 37oC, CO2 5%.
2.3.13. Phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang Chuẩn bị tế bào
Ly tâm dịch tế bào nuôi cấy ở 1500 v/ph, 5 phút, bỏ dịch, thu sinh khối tế bào. Số tế bào cần dùng là 105 – 106 tế bào.
Rửa tế bào bằng 1 mL dung dịch PBS 1X. Ly tâm với tốc độc 1500 v/ph khoảng 5 phút, loại dịch nổi, thu tế bào.
Cố định tế bào
Ủ tế bào với 400 µL dung dịch paraformaldehyde 4% (pH 7.4) khoảng 10 phút . Sau đó ly tâm 1500 v/ph, 5 phút.
Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 800 µL dung dịch PBS 1X vào ống tế bào, đảo trộn đều. Sau đó ly tâm 1500 v/ph, 5 phút, loại dịch nổi, thu tế bào.
Làm thấm màng tế bào
Bổ sung 700 µL dung dịch đệm PBS 1X chứa Triton X-100 0.1%, đảo trộn đều và ủ tế bào ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút.
Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 800 µL dung dịch PBS 1X vào ống tế bào, đảo trộn đều. Sau đó ly tâm 1500 v/ph, 5 phút, loại dịch nổi, thu tế bào.
Blocking
Bổ sung 1 mL dung dịch đệm PBS 1X chứa BSA 2% vào tế bào. Ủ tế bào ở nhiệt độ phòng khoảng 60 phút.
Ủ tế bào với kháng thể
21
Mẫu 1: Tế bào Jurkat ủ với kháng thể anti-CD47-GFP (đặt của hãng Biosciences)
Pha loãng kháng thể anti-CD47-GFP trong 500 µL dung dịch đệm PBS chứa BSA 0.1% theo tỷ lệ 1:50 và bổ sung vào tế bào, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 3 h.
Rửa tế bào 3 lần với 500 µL dung dịch đệm PBS 1X bằng cách ly tâm ở 1500 v/ph, 5 phút.
Hòa tan tế bào trong 100 µL dung dịch PBS 1X, sau đó hút dịch tế bào vào đĩa chuyên dụng để quan sát tế bào dƣới kính hiển vi huỳnh quang. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu 2: tế bào Jurkat ủ với kháng thể tái tổ hợp anti-CD47 sau đó ủ tiếp với kháng thể anti-CD47-GFP.
Pha loãng kháng thể tái tổ hợp anti-CD47 trong 500 µL dung dịch đệm PBS chứa BSA 0.1% theo tỷ lệ 1:20 và bổ sung vào tế bào, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 3 h.
Rửa tế bào 3 lần với 500 µL dung dịch đệm PBS 1X bằng cách ly tâm ở 1500 v/ph, 5 phút.
Pha loãng kháng thể anti-CD47-GFP trong 500 µL dung dịch đệm PBS chứa BSA 0.1% theo tỷ lệ 1:50 và bổ sung vào tế bào, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 3 h.
Rửa tế bào 3 lần với 500 µL dung dịch đệm PBS 1X bằng cách ly tâm ở 1500 v/ph, 5 phút.
Hòa tan tế bào trong 100 µL dung dịch PBS 1X, sau đó hút dịch tế bào vào đãi chuyên dụng để quan sát tế bào dƣới kính hiển vi huỳnh quang.
22
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nhân gen mã hóa kháng thể kháng CD47
Gen mã hóa kháng thể kháng CD47 (anti-CD47) có kích thƣớc khoảng 900 bp chứa một khung đọc mở mã hóa cho kháng thể có cấu trúc dạng scFv. Gen anti- CD47 đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu LH47F/LH47R. Kết quả của phản ứng PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và đƣợc thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả nhân gen anti-CD47 bằng phản ứng PCR. Cặp mồi LH47F/LH47R đặc hiệu gen anti-CD47. (-): Đối chứng âm không có khuôn, 1. Marker 1 kb, 2. Sản phẩm PCR
kích thƣớc 900 bp.
Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy ở giếng số 2 xuất hiện băng đậm có kích thƣớc khoảng 900 bp phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thƣớc của gen
anti-CD47. Kết quả này cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc có chất lƣợng tốt và phản ứng nhân gen bằng phƣơng pháp PCR của chúng tôi đã thực hiện thành công. Tiếp theo, sản phẩm nhân gen anti-CD47 đƣợc dùng để gắn nối vào vector pET22b+ nhằm tạo ra vector tái tổ hợp mang gen anti-CD47.
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b+ mang gen anti-CD47
3.2.1. Cắt vector pET22b+ và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn
Vector pET22b+ và sản phẩm PCR đƣợc cắt đồng thời bằng hai enzyme cắt giới hạn là BamHI và XhoI. Phản ứng cắt đƣợc ủ ở 37oC qua đêm. Kết quả của
1 (-) 2
23
phản ứng cắt vector đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với vector pET22b+ gốc và đƣợc thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Cắt vector pET22b+ bằng enzyme cắt giới hạn. Vector pET22b+ đƣợc cắt đồng thời bằng hai enzyme BamHI và XhoI, phản ứng cắt đƣợc ủ ở 37oC, qua đêm. 1.Marker
1kb, 2. vector pET22b+ sau khi cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn, 3. vector pET22b+.
Kết quả điện di trên Hình 3.2 cho thấy vector pET22b+ đã đƣợc cắt mở vòng bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và XhoI, sản phẩm cắt là 1 băng duy nhất với kích thƣớc 5493 bp nằm giữa hai băng 5000 bp và 6000 bp của marker (đƣờng chạy 2).
3.2.2. Kết quả gắn tạo thành công vector tái tổ hợp mang gen anti-CD47
Kết quả gắn nối sản phẩm PCR vào vector pET22b+
Sản phẩm PCR và vector pET22b+ sau khi cắt đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch (GeneJET PCR Purification Kit) và đƣ ợc dùng để gắn nối với nhau bằng enzyme T4 ligase nhằm tạo vector biểu hiện tái tổ hợp. Sau đó, sản phẩm gắn nối đƣợc biến nạp vào chủng tế bào khả biến E. coli DH5αbằng phƣơng pháp sốc nhiệt.
Dịch tế bào sau biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB/agar bổ sung Amp 100 µg/ml. Sau khi ủ qua đêm ở 37oC, các khuẩn lạc trắng mọc trên đĩa thạch (Hình 3.3).
24
Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối gen giữa sản phẩm PCR (khuếch đại gen
antiCD47) và vector pET22b+ vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Tế bào đƣợc ủ ở 37oC qua đêm để quan sát rõ hình thái khuẩn lạc trắng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả trên Hình 3.3 cho thấy các khuẩn lạc phát triển đƣợc trên môi trƣờng có kháng sinh ampicilin là do plasmid có mang gen kháng ampicilin. Hình thái của các khuẩn lạc trắng tròn đều, không bị nhiễm, chƣa có khuẩn lạc vệ tinh (do thời gian ủ thích hợp, các khuẩn lạc chƣa kịp phân giải Ampicilin trong môi trƣờng nên các khuẩn lạc vệ tinh chƣa kịp mọc). Điều này cho thấy quá trình gắn nối sản phẩm PCR đầu bằng vào vector pET-22b+ và quá trình biến nạp bằng phƣơng pháp sốc nhiệt đã đƣợc chúng tôi thực hiện thành công.
Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc màu trắng mọc và phát triển đƣợc trên môi trƣờng LB/agar có Amp đều mang plasmid tái tổ hợp chứa gen cần tách dòng mà còn có cả vector gốc pET-22b+ tự đóng vòng. Do đó chúng tôi thực hiện các thí nghiệm tiếp theo để sàng lọc đƣợc các khuẩn lạc thực sự có mang plasmid tái tổ hợp, đó là: tách chiết plasmid, kiểm tra plasmid bằng phƣơng pháp PCR với mồi T7 promoter/T7 terminator.
Kiểm tra sơ bộ các dòng mang gen anti-CD47
Chúng tôi chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc trắng mọc trên môi trƣờng kháng sinh chọn lọc để tách plasmid nhằm chọn đƣợc các dòng plasmid mang gen
25
Hình 3.4. Kiểm tra sơ bộ các dòng plasmid tái tổ hợp mang gen anti-CD47. Hình ảnh điện di so sánh kích thƣớc của 5 dòng với vector gốc pET22b+. 1. vector gốc pET22b+, 2. plasmid
dòng 1, 3. Plasmid dòng 2, 4. Plasmid dòng 3, 5. Plasmid dòng 4, 6. plasmid dòng 5.
Do đƣợc gắn thêm gen anti-CD47 nên kích thƣớc của vector tái tổ hợp lớn hơn kích thƣớc của vector pET22b+ gốc.
Phân tích Kết quả điện di trên Hình 3.4 cho thấy ở các đƣờng chạy 1,2,3 và 5 đều xuất hiện 2 băng đó là hai dạng cấu trúc cuả plasmid. Trong đó plasmid ở đƣờng chạy số 1,3 và 5 sáng và rõ hơn có băng cao hơn plasmid gốc nên chúng đều có khả năng mang gen anti-CD47. Để khẳng định chắc chắn, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với khuôn là các dòng plasmid trên cùng với đối chứng là plasmid gốc với cặp mồi T7 promoter/T7 terminantor. Kết quả của phản ứng PCR đƣợc thể hiện trên Hình 3.5 dƣới đây.
26
Hình 3.5. Kiểm tra các dòng plasmid mang gen anti-CD47. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi T7 promoter/T7 terminator, khuôn là plasmid gốc, plasmid dòng 1, 3 và 5. Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid gốc có kích thƣớc khoảng 309 bp, sản phẩm PCR
của các dòng tái tổ hợp có kích thƣớc khoảng 1300 bp. 1. plasmid gốc pET22b+, 2. plasmid dòng số 1, 3. plasmid dòng số 3, 4. plasmid dòng số 5, 5. Marker 1 kb.
Cặp mồi T7 promoter/T7 terminator bắt cặp đặc hiệu với trình tự nucleotide từ vùng đầu đến vùng cuối của vùng MCS (vùng đa tách dòng) trên vector pET22b+. Do đó khi đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR, plasmid gốc đƣợc nhân băng kích thƣớc khoảng 300 bp, plasmid tái tổ hợp đƣợc nhân băng kích thƣớc khoảng 1300 kb. Kết quả điện di trên Hình 3.5 cho thấy các sản phẩm PCR có kích thƣớc phù hợp với tính toán lý thuyết, các dòng plasmid 1, 3 và 5 đều là các dòng plasmid tái tổ hợp. Chúng tôi chọn dòng số 1 để giải trình tự gen.
Kết quả giải trình tự gen
Sử dụng cặp mồi T7 promoter/T7 terminator của vector để giải trình tự gen dòng số 1 thu đƣợc trình tự nucleotite và dịch mã trình tự này sang trình tự axit amin chúng tôi đƣợc kết quả nhƣ sau:
1 M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P A 1 ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCG 21 M A M D I G I N S D P E E L Q V I Q P D 61 ATGGCCATGGATATCGGAATTAATTCGGATCCGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGAC 41 K S V L V A A G E T A T L R C T A T S L 121 AAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAGACAGCCACTCTGCGCTGCACTGCGACCTCTCTG 61 I P V G P I Q W F R G A G P G R E L I Y 181 ATCCCTGTGGGGCCCATCCAGTGGTTCAGAGGAGCTGGACCAGGCCGGGAATTAATCTAC 81 N Q K E G H F P R V T T V S D L T K R N 241 AATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGACCTCACAAAGAGAAAC 101 N M D F S I R I G N I T P A D A G T Y Y 301 AACATGGACTTTTCCATCCGCATCGGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTAC 121 C V K F R K G S P D D V E F K S G A G T 361 TGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCCGATGACGTGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACT 141 E L S V R A K P S A P V V S G P A A R A 421 GAGCTGTCTGTGCGCGCCAAACCCTCTGCCCCCGTGGTATCGGGCCCTGCGGCGAGGGCC 161 T P Q H T V S F T C E S H G F S P R D I 481 ACACCTCAGCACACAGTGAGCTTCACCTGCGAGTCCCACGGCTTCTCACCCAGAGACATC
27 181 T L K W F K N G N E L S D F Q T N V D P 541 ACCCTGAAATGGTTCAAAAATGGGAATGAGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACCCC 201 V G E S V S Y S I H S T A K V V L T R E 601 GTAGGAGAGAGCGTGTCCTACAGCATCCACAGCACAGCCAAGGTGGTGCTGACCCGCGAG 221 D V H S Q V I C E V A H V T L Q G D P L 661 GACGTTCACTCTCAAGTCATCTGCGAGGTGGCCCACGTCACCTTGCAGGGGGACCCTCTT 241 R G T A N L S E T I R V P P T L E V T Q 721 CGTGGGACTGCCAACTTGTCTGAGACCATCCGAGTTCCACCCACCTTGGAGGTTACTCAA 261 Q P V R A E N Q V N V T C Q V R K F Y P 781 CAGCCCGTGAGGGCAGAGAACCAGGTGAATGTCACCTGCCAGGTGAGGAAGTTCTACCCC 281 Q R L Q L T W L E N G N V S R T E T A S 841 CAGAGACTACAGCTGACCTGGTTGGAGAATGGAAACGTGTCCCGGACAGAAACGGCCTCA 301 T V T E N K D G T Y N W M S W L L V N V 901 ACCGTTACAGAGAACAAGGATGGTACCTACAACTGGATGAGCTGGCTCCTGGTGAATGTA 321 S A H R D D V K L T C Q V E H D G Q P A 961 TCTGCCCACAGGGATGATGTGAAGCTCACCTGCCAGGTGGAGCATGACGGGCAGCCAGCG 341 V S K S H L E H H H H H H *
1021GTCAGCAAAAGCCATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
Hình 3.6. Trình tự nucleotide của gen mã hóa kháng thể anti-CD47 và trình tự axit amin của kháng thể anti-CD47. Trình tự axit đƣợc đánh dấu màu xanh lá cây là đuôi His-tag. Mã
mở đầu ATG và mã kết thúc TGA đƣợc đánh dấu màu đỏ.
Kết quả giải trình tự cho thấy dòng số 1 mang đúng trình tự gen mã hóa kháng thể anti-CD47 bao gồm 1059 nucleotide, có mã mở đầu ATG và mã kết thúc TGA . Sáu bộ ba mã hóa cho Histidine nằm trƣớc mã kết thúc nên protein đích biểu hiện chứa đuôi His-tag thuận lợi cho việc phát hiện và tinh sạch. Đoạn genmã hóa kháng thể anti-CD47 đƣợc gắn vào vector pET22b+ đúng chiều, đúng khung đọc và không có đột biến. Dịch mã từ trình tự nucleotide của gen mã hóa kháng thể anti- CD47 sang trình tự axit amin, chúng tôi thu đƣợc một protein có trình tự gồm 353 axit amin tƣơng đƣơng với khối lƣợng xấp xỉ 39 kDa đúng với kích thƣớc của kháng thể anti-CD47 theo tính toán lý thuyết. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã thiết kế và tạo thành công vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b+ mang gen mã hóa kháng thể anti-CD47.
28
3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện
E.coli
Dòng plasmid số 1 sau khi khẳng định bằng phƣơng pháp giải trình tự gen đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến BL21 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt và đƣợc nuôi cấy chọn lọc trên môi trƣờng LB agar có bổ sung Ampicilin 1000 µg/mL ở 37oC qua đêm. Trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng chứng tỏ các khuẩn lạc này đều mang vector tái tổ hợp. Tiếp theo, cấy hoạt hóa 1 khuẩn lạc vào môi trƣờng LB bổ sung Ampicilin 1000 µg/mL qua đêm. Cấy chuyển 1% thể tích dịch môi trƣờng nuôi cấy qua đêm sang môi trƣờng LB mới bổ sung Ampicilin µg/mL theo thể tích phù hợp, nuôi lắc tế bào ở 37oC cho đến khi OD của môi trƣờng đạt 0.6-0.8 thì bổ sung IPTG để cảm ứng biểu hiện protein đích. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát 2 nồng độ IPTG là 0.5 mM và 1 mM, thời gian biểu hiện là 3h và 16h, nhiệt độ biểu hiện ở 25oC, 30oC và 37oC. Protein tổng số của các thí nghiệm đã khảo sát đƣợc điện di đồng thời trên cùng 1 bản gel SDS-PAGE 12% (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kiểm tra sự biểu hiện của kháng thể kháng CD47 ở tế bào vi khuẩn E.coli
BL21DE3 bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE. M. marker protein, 1. Mẫu trƣớc cảm ứng, 2. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 3h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37oC, 3. Mẫu cảm ứng IPTG 1 mM thu mẫu sau 3h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37oC, 4. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5
29
mM, thu mẫu sau 5h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37oC, 5. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37 o
C, 6. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 25oC, 7. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 30oC, 8. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhiệt độ nuôi cấy 37o C.
Kết quả điện di trên Hình 3.7 cho thấy khi có mặt chất cảm ứng IPTG ở tất cả các mẫu đã khảo sát tƣơng ứng với các đƣờng chạy từ 2-8 đều xuất hiện một băng đậm có kích thƣớc khoảng 39 kDa đƣợc dự đoán là kích thƣớc của kháng thể anti-CD47. Trong khi đó, mẫu không đƣợc cảm ứng IPTG (đƣờng chạy số 1) không có băng này. Ở nồng độ chất cảm ứng 0.5 mM, thời gian cảm ứng 3 h, nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, protein đích đƣợc biểu hiện mạnh nhất thể hiện qua băng đậm (đƣờng chạy số 2). Tại nồng độ IPTG 0.5 mM, thời gian cảm ứng 16 h và nhiệt độ nuôi cấy lần lƣợt là 25oC, 30oC và 37oC, hình ảnh điện di cho thấy protein đích biểu hiện tƣơng ứng với các băng có độ đậm nhƣ nhau. Để rút ngắn thời gian nuôi cấy, chúng