b. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
3.1. Kết quả tách chiết ADN
ADN sau khi tách chiết được tiến hành điện di trên gel agarose nhằm xác định độ tinh sạch, độ nguyên vẹn của mẫụ Kết quả tách chiết cho thấy các băng ADN của 16 mẫu nghiên cứu gọn, rõ, không có vệt sáng của ARN. Mẫu đã tách chiết đủ độ tinh sạch, nguyên vẹn, đủ điều kiện cho các thí nghiệm tiếp theọ
3.2. Phân tích mối quan hệ giữa các dòng, giống lúa đột biến dựa trên kết quả đa hình của mồi RAPD
Sau khi tiến hành xong các phản ứng PCR, thống kê trên 14 mồi PCR_RAPD đã được sử dụng trong nghiên cứu chúng tôi thu được 987 loại phân đoạn ADN đã được nhân bản trong đó có 984 đoạn đa hình và 3 đoạn đơn hình.
Trong số 14 mồi RAPD đã nghiên cứu có 6 mồi có tính đa hình cao với 9 – 13 đoạn được nhân cho mỗi mồị Đó là các mồi: OPC4, OPC5, OPC15, OPN12, OPN17, OPM6. Phân tích kết quả với một số mồi đặc trưng ta có.
3.2.1. Mồi OPC4
Kết quả điện di sản phẩm RAPD (hình 3.1) của các dòng giống lúa với mồi OPC4 có từ 5 – 11 phân đoạn được nhân ngẫu nhiên (Bảng 3.1). Trong đó dòng số 5 và dòng số 7 có số phân đoạn được nhân bản nhiều nhất là 11; dòng số 1, 8, 9 có 5 phân đoạn được nhân bản.
Tính đa hình được thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn ADN khi so sánh giữa các giống, dòng với nhaụ ở mồi OPC4 có 12 băng đa hình được nhân lên.
Khóa luận tốt nghiệp
Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD ở 16 giống (dòng) lúa với mồi OPC4
(Các giếng từ trái qua phải tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúa)
Bảng 3.1 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng PCR- RAPD với mồi OPC4
đđn Thứ tự các giống (dòng) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 2 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 5 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 8 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 9 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 10 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 tpđ 5 6 9 9 11 10 11 5 5 9 6 10 7 10 7 8
Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn được nhân của mỗi mẫu; đđn: thứ tự đoạn
Khóa luận tốt nghiệp 3.2.2. Mồi OPC5
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD ở 16 giống (dòng) lúa với mồi OPC5
(Các giếng từ trái qua phải tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúa). Bảng 3.2 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng
PCR – RAPD với mồi OPC5 đđn Thứ tự các giống (dòng) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 2 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 3 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 4 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1` 1 1 1 1 1 5 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 6 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 7 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 8 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 tpđ 3 3 4 3 6 6 4 5 3 6 5 7 3 2 2 3
Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn được nhân của mỗi mẫu; đđn: thứ tự đoạn
Khóa luận tốt nghiệp
Kết quả điện di cho ta từ 2 – 7 băng ADN được nhân lên của 16 giống lúa nghiên cứụ Số băng được nhân lên ở giống số 12 nhiều nhất là 7 băng, giống số 14 và 15 chỉ có 2 băng ADN được nhân ngẫu nhiên.
Tổng số băng ADN được nhân bản của 16 giống lúa với mồi OPC5 là 65 đoạn trong đó có 64 đoạn đa hình và một đoạn đơn hình.
3.2.3. Mồi OPN12
Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR- RAPD ở16 giống (dòng) lúa với mồi OPN12
(Các giếng từ trái qua phải tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúa).
Kết quả điện di sản phẩm RAPD (Hình 3.3) của các giống (dòng) lúa với mồi OPN12 có từ 4 – 12 phân đoạn được nhân ngẫu nhiên và có 13 băng đa hình được nhân lên (Bảng 3.3). Trong đó giống (dòng) số 9 có phân đoạn ADN được nhân nhiều nhất là 10 phân đoạn, 2 giống số 16 và số 4 có 4 phân đoạn được nhân bản.
Khóa luận tốt nghiệp
Bảng 3.3 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng PCR – RAPD với mồi OPN12
đđn 1 2 3 4 5 6 Thứ tự các giống (dòng) 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 5 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 7 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 8 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 11 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 13 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 tpđ 6 7 6 4 5 9 6 5 10 7 5 6 9 7 5 4
Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn được nhân của mỗi mẫu; đđn: thứ tự đoạn
được nhân. Số 1: đoạn ADN được nhân, số 0: đoạn ADN không được nhân.
3.2.4. Mồi OPM6
Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR- RAPD ở16 giống (dòng) lúa với mồi OPM6
Khóa luận tốt nghiệp
Bảng 3.4 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng PCR – RAPD với mồi OPM6
đđn 1 2 3 4 5 6 Thứ tự các giống (dòng) 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 2 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 3 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 4 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 5 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 7 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 8 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 9 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 10 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 11 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 tpđ 4 8 9 6 6 7 7 7 6 6 5 4 2 4 7 4
Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn được nhân của mỗi mẫu; đđn: thứ tự đoạn
được nhân Số 1: đoạn ADN được nhân, số 0: đoạn ADN không được nhân. Mồi OPM6 sau khi phân tích điện di PCR_RAPD cho ta 2 – 9 phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên. Có tổng cộng 12 băng ADN đa hình trong đó, giống số 3 cho số băng ADN được nhân ngẫu nhiên cao nhất là 9, thấp nhất là giống số 13 chỉ có 2 băng đa hình được nhân.
Thống kê số lượng các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trên cả 6 mồi PCR_RAPD ta thu được bảng saụ
Bảng 3.5 Tổng số các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên của các mồi đa hình. Tên mồi 1 2 3 4 5 6 Thứ tự các giống (dòng) 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 OPC4 5 6 9 9 11 10 11 5 5 9 6 10 7 10 7 8 OPC5 3 3 4 3 6 6 4 5 3 6 5 7 3 2 2 3 OPC15 4 3 2 4 4 6 6 3 3 3 5 2 3 3 4 2 OPN12 5 3 7 4 6 8 5 6 5 4 2 4 6 7 7 7 OPN17 6 7 6 4 5 9 6 5 10 7 5 6 9 7 5 4 OPM6 4 8 9 6 6 7 7 7 6 6 5 4 2 4 7 4
Khóa luận tốt nghiệp
Nhận xét: Số lượng băng đa hình của 16 giống (dòng) lúa ở mồi OPC4
là cao nhất (128 băng). Thấp nhất là OPC15 (57 băng). Số lượng các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên đối với các mồi theo thứ tự là:
OPC4 (128) > OPN12 (101) > OPM6 (92) > OPN17 (86) > OPC5 (65) > OPC15 (57)
Bảng 3.6 Thống kê các mồi xuất hiện đa hình.
SST Tên mồi Số băng được nhân Số băng đa hình
1 OPC4 12 12 2 OPC5 9 8 3 OPC15 8 8 4 OPN12 13 13 5 OPN17 10 10 6 OPM6 12 12 7 Số mồi đa hình 6 64 63
Nhận xét: các giá trị thống kê ở bảng 3.6 phù hợp với bảng 3.5. Trong các
nghiên cứu tiếp theo cần tìm hiểu giá trị của các mồi trên những đối tượng khác nhau để khẳng định tính đa hình của các mồi trên.
3.3. Mối quan hệ giữa các giống lúa dựa trên phân tích RAPD
Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn ADN của các mẫu điện di sản phẩm RAPD, chúng tôi thiết lập mối liên quan giữa các dòng (giống) lúa ở mức độ phân tử. Mức độ khác nhau được biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các dòng (giống) lúa đột biến. Các dòng có hệ số di truyền cao sẽ được xếp vào một nhóm. Giữa các nhóm lại có sự liên hệ về mức độ giống nhau của hệ số tương đồng di truyền.
Kết quả nhận được trình bày ở bảng 3.7 về mối tương quan di truyền từng cặp và hình 3.5 dưới dạng một sơ đồ hình câỵ
Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.7 Ma trận tương đồng của 16 giống (dòng) lúa đột biến
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 1.00 2 0.45 1.00 3 0.33 0.36 1.00 4 0.50 0.51 0.30 1.00 5 0.46 0.26 0.36 0.44 1.00 6 0.45 0.64 0.38 0.67 0.44 1.00 7 0.55 0.51 0.51 0.55 0.43 0.60 1.00 8 0.41 0.40 0.29 0.52 0.35 0.52 0.53 1.00 9 0.40 0.35 0.23 0.42 0.31 0.42 0.48 0.42 1.00 10 0.35 0.27 0.26 0.35 0.42 0.39 0.30 0.35 0.31 1.00 11 0.48 0.38 0.28 0.53 0.51 0.53 0.50 0.39 0.44 0.37 1.00 12 0.50 0.47 0.33 0.59 0.35 0.55 0.51 0.52 0.36 0.47 0.58 1.00 13 0.45 0.59 0.31 0.66 0.36 0.58 0.59 0.52 0.52 0.33 0.50 0.55 1.00 14 0.55 0.51 0.32 0.55 0.30 0.55 0.56 0.44 0.35 0.38 0.50 0.60 0.55 1.00 15 0.26 0.22 0.47 0.28 0.38 0.36 0.34 0.35 0.20 0.37 0.38 0.39 0.30 0.34 1.00 16 0.31 0.25 0.13 0.25 0.08 0.25 0.36 0.17 0.21 0.06 0.18 0.19 0.19 0.30 0.00 1.00
Chú thích: các số từ 1-16 tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúạ
Coefficient 0.20 0.32 0.44 0.56 0.68 D52N A-20 D52 CL8-1 XH-1 HD-1DB CL-9 XH-3 HD-1LM D51 BT-7 HD-01 HD-02 D53 XH-5 IR-64
Hình 3.5 Sơ đồ hình cây của 16 giống (dòng) lúa đột biến
Phân tích bảng 3.7 cho thấy các giống lúa có hệ số tương đồng di truyền từng cặp nằm trong khoảng từ 0,13 – 0,67. Cá biệt giữa 2 giống XH-5 và
Khóa luận tốt nghiệp
IR-64 có mức độ tương đồng 0,00 tức là 2 giống không tương đồng di truyền. Cao nhất là hệ số tương đồng di ruyền giữa 2 giống D52 và giống CL8-1.
Dựa vào sự sai khác về mức độ tương đồng di truyền ở 44% chúng tôi chia sơ đồ hình cây của 16 giống (dòng) lúa đột biến thành 9 nhóm chính:
Nhóm 1: Gồm các dòng (giống) A20, D52, CL8-1, XH-1 có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,40 (1 – 0,60). Được chia thành 2 nhóm phụ
Nhóm phụ 1: Chỉ có dòng (giống) A20.
Nhóm phụ 2: Gồm các dòng (giống) D52, CL8-1, XH-1.
Nhóm 2: Dòng HD-1DB, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,44 (1 – 0,56).
Nhóm 3: Gồm các dòng (giống) CL9 và XH-3, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,46 (1 – 0,54).
Nhóm 4: Dòng HD1-LM, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,53 (1 – 0,47).
Nhóm 5: Dòng (giống) D51 và BT7, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,49 (1 – 0,51).
Nhóm 6: Dòng HD-01, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,58 (1 – 0,42).
Nhóm 7: Dòng HD-01, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,63 (1 – 0,37).
Nhóm 8: Dòng D53 và XH-5, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,67 (1 – 0,33).
Nhóm 9: Dòng (giống) IR-64, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,80 (1 – 0,20).
Khóa luận tốt nghiệp
Kết luận và đề nghị
1. Kết luận
- Đã tách chiết được ADN từ 16 giống (dòng) lúa đột biến nghiên cứu với độ tinh sạch cao, đủ diều kiện để làm phản ứng PCR.
- Đã sử dụng 14 mồi ngẫu nhiên để nghiên cứu đa hình và xác định được 6 mồi cho độ đa hình cao đó là các mồi: OPC4, OPC5, OPC15, OPN12, OPN17, OPM6.
- Xử lý số liệu thu được cho kết quả: đã xác định được mức độ sai khác giữa các dòng, giống lúa nghiên cứu với hệ số tương đồng di truyền nằm trong khoảng 0,13 – 0,67.
- Từ sơ đồ hình cây thu được chúng tôi xác định ở mức độ tương đồng 44% 16 giống, dòng lúa được chia thành 9 nhóm đó là:
+ Nhóm 1: Gồm các dòng (giống) A20, D52, CL8-1, XH-1 + Nhóm 2: Dòng HD-1DB + Nhóm 3: Gồm các dòng (giống) CL9 và XH-3 + Nhóm 4: Dòng HD1-LM + Nhóm 5: Dòng (giống) D51 và BT7 + Nhóm 6: Dòng HD-01 + Nhóm 7: Dòng HD-01 + Nhóm 8: Dòng D53 và XH-5 + Nhóm 9: Dòng (giống) IR-64 2. Đề nghị
Sử dụng chỉ thị phân tử là biện pháp nghiên cứu đa hình di truyền có hiệu quả, nhất là trong công tác chọn tạo giống lúạ Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống, nhất là chọn giống từ nguồn đột biến nhằm rút ngắn thời gian chọn tạo, và chọn được cặp lai ưu tú.
Khóa luận tốt nghiệp
Tiếp tục khảo sát thêm một số mồi RAPD, AFLP để khẳng định sự đa hình di truyền của các giống (dòng) lúa đột biến nàỵ
Sử dụng chỉ thị RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền về các dòng lúa đột biến triển vọng đã phần nào xác định được sự sai khác về nguồn gốc của các dòng đột biến so với giống gốc. Tuy nhiên, cần nghiên cứu để xác định điểm đột biến và giải trình tự gen đột biến trên các dòng nghiên cứu, từ đó có thể cung cấp nguồn vật liệu rõ ràng cho công tác chọn tạo giống lúa chất lượng tiếp theọ
Khóa luận tốt nghiệp Tài liệu tham khảo
1. Bùi Mạnh Cường, (2007), Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống ngô, NXB Nông Nghiệp.
2. Trịnh Đình Đạt, Nguyễn Văn Niệm, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Lê Trung Kiên, (1999), Nghiên cứu một số izozym của ong nội (Apis
ceruna) ở 4 địa phương khác nhau, báo cáo khoa học.
3. Trịnh Đình Đạt, (2007), Công nghệ sinh học (tập 4), NXB Giáo dục. 4. Nguyễn Văn Đồng, (1998), Nghiên cứu phát hiện và lập bản đồ phân
tử gen bất dục đực nhạy cảm với nhiệt độ (TGMS) ở lúa – Luận án tiến
sĩ nông nghiệp.
5. Nguyễn Hữu Đống, KS Đào Thanh Bình, KS Lâm Quang Dụ, KS Phan Đức Trực, (1997), Đột biến: cơ sở lý thuyết và ứng dụng, NXB nông nghiệp.
6. Phạm Thành Hổ, (2006), Di truyền học, NXB Giáo dục.
7. Phạm Xuân Hội, Trần Duy Quý, (2002), Công nghệ gen trong việc tăng
sản lượng lúa, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng số 1/2001, Viện
di truyền Nông nghiệp – Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn.
8. IRRI, (1996), Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa, tái bản lần thứ 4- 1996.
9. Phan Cự Nhân, (2006), Di truyền học (tập 1,2), NXB Đại học Sư phạm. 10. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, (2005), ứng dụng Marker phân tử
đánh dấu gen mùi thơm trên lúa, Tạp chí di truyền học và ứng dụng.
11. Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga, (2004), Hình thái giải phẫu học
thực vật, NXB Đại học Sư phạm.
12. Hoàng Thị Sản, Nguyễn Thị Bé, (2006), Phân loại học thực vật, NXB Đại học Sư phạm.
Khóa luận tốt nghiệp
13. Hoàng Thị Sản, (1999), Phân loại học thực vật, NXB Giáo dục.
14. Đào Xuân Tân, (2003), Đặc điểm hình thái và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng lúa đột biến từ giống IR-64 và A20 ở thế hệ thứ 3, Thông báo khoa học ĐHSP Hà Nội 2.
15. Lê Duy Thành, (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
16. Trương Bá Thảo, (2006), ứng dụng chỉ thị phân tử trên cơ sở phản ứng
chuỗi Polymerase (PCR) để chọn tạo giống lúa (Oryza sativa L.), Luận
án tiến sĩ nông nghiệp, Cần Thơ- 2006.
17. Trần Duy Quý, (1997), Các phương pháp trong chọn tạo giống cây
trồng, NXB Nông nghiệp.
18. Báo cáo khoa học, (1993 - 2003) – Hội nghị sinh học toàn quốc năm
2003, NXB Khoa học Kỹ thuật – 2003.
19. Ahn, SN., Bollich CN., Tanksley SD., (1992), RFLP tagging of a gen for aroma in rice, Theor, Appl.