b. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
2.3.4.Tiến hành phản ứng PCR
Phản ứng PCR được tiến hành trong ống eppendorf 0,2 ml và được thực hiện trên máy Master cycle 5330. Thành phần của phản ứng được liệt kê như sau:
Khóa luận tốt nghiệp STT Thành phần phản ứng Thể tích (l) 1 H2O 9,2 2 PCR Buffer 10X 1,5 3 dNTPs 10 mM 0,6 4 MgCl2 25 mM 1,0 5 Mồi (primer) 15 ng/l 1,5
6 Taq polymerase (4U) 0,2
7 ADN 25 ng/l 1,0
8 Tổng thể tích 15
Các mồi RAPD gồm 14 mồi thuộc 4 nhóm OPA, OPC, OPM, OPN, kích thước 10 nucleotide, của nhà sản xuất Operon Technologies và Bioneer Chương trình của phản ứng PCR_RAPD cho mồi ngẫu nhiên như sau:
Nhiệt độ (0C) Thời gian(phút) Tác dụng Số chu kỳ 95 6 Biến tính 95 1 Biến tính 35 1 Gắn mồi 72 2,5 Tổng hợp 72 7 Tổng hợp 4 Bảo quản 45 2.3.5 Phương pháp điện di sản phẩm PCR
Các phản ứng sau khi đã kết thúc được lấy ra kiểm tra và phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% và được nhuộm bằng ethidium bromide, tiến hành như sau:
Bước 1: Chuẩn bị gel điện di
Khóa luận tốt nghiệp
+ Agarose:1,5g + TAE 1X: 100ml
Đun sôi dung dịch trên trong lò vi sóng để agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội đến 500C, bổ sung 10l Ethidium bromide và đổ vào khay gel đã cài lược sẵn. Sau 30 – 60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho ngập bản gel khoảng 0,5 – 1 cm
Bước 2 : Tra sản phẩm PCR vào giếng
Sản phẩm PCR sau khi lấy ra khỏi máy được tra vào trong giếng theo công thức sau:
+ Sản phẩm PCR : 8l + Xylen cyanol: 2l
Trên bản gel để lại một giếng để nạp 1 kb lađer.
Bước 3: Tiến hành điện di
Sau khi tra mẫu xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn đặt ở thông số sau:
+ Điện thế: 50 V + Cường độ: 90 mA
Bước 4: Sau khi điện di xong, soi bản gel trên máy soi gel bằng tia UV, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr
Bước 5: Chụp ảnh các băng ADN và xử lý trên chương trình NTSYS.
2.2.6. Phân tích kết quả PCR bằng NTSYS - Version 2.0
* Cơ sở dữ liệu của NTSYS - Version là chương trình máy tính để tự động thiết lập sơ đồ hình cây biểu hiện mối quan hệ hay độ tương đồng di truyền của các đối tượng cần nghiên cứu sau khi nhập dữ liệụ Qua sơ đồ ta có thể đánh giá được mối quan hệ di truyền giữa chúng với nhaụ Cơ sở dữ liệu của chương trình này dựa vào hệ mã nhị phân (0, 1) để đánh giá sự vắng mặt (ghi 0) hoặc có mặt (ghi 1) của các băng đa hình ADN nghiên cứu theo thang ADN
Khóa luận tốt nghiệp
chuẩn (ADN marker). Dữ liệu này cũng cho phép thiết lập ma trận tương đồng (Similar matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Hệ số tương đồng di truyền giữa 2 mẫu nghiên cứu được xác định theo công thức sau: 2AB
SAB = A + B
AB: số băng giống nhau giữa 2 mẫu A và B A: số băng của mẫu A
B: số băng của mẫu B
SAB: hệ số tương đồng giữa 2 mẫu A và B
Từ SAB ta suy ra được mức độ sai khác về di truyền giữa A, B DAB = 1 - SAB.
* Trình tự tiến hành phân tích kết quả PCR_RAPD bằng NTSYS (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả PCR_RAPD được nhập vào chương trình excel theo nguyên tắc: nếu không xuất hiện băng ghi “ 0 ”, nếu xuất hiện băng ghi “ 1 ”.
Số liệu được xử lý tiếp trong chương trình Notepad và ghi lại trong đĩạ Ma trận tương đồng và sơ đồ hình cây được xây dựng sau khi xử lý trong NTSYS
Khóa luận tốt nghiệp
Chương 3. kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Kết quả tách chiết ADN
ADN sau khi tách chiết được tiến hành điện di trên gel agarose nhằm xác định độ tinh sạch, độ nguyên vẹn của mẫụ Kết quả tách chiết cho thấy các băng ADN của 16 mẫu nghiên cứu gọn, rõ, không có vệt sáng của ARN. Mẫu đã tách chiết đủ độ tinh sạch, nguyên vẹn, đủ điều kiện cho các thí nghiệm tiếp theọ
3.2. Phân tích mối quan hệ giữa các dòng, giống lúa đột biến dựa trên kết quả đa hình của mồi RAPD
Sau khi tiến hành xong các phản ứng PCR, thống kê trên 14 mồi PCR_RAPD đã được sử dụng trong nghiên cứu chúng tôi thu được 987 loại phân đoạn ADN đã được nhân bản trong đó có 984 đoạn đa hình và 3 đoạn đơn hình.
Trong số 14 mồi RAPD đã nghiên cứu có 6 mồi có tính đa hình cao với 9 – 13 đoạn được nhân cho mỗi mồị Đó là các mồi: OPC4, OPC5, OPC15, OPN12, OPN17, OPM6. Phân tích kết quả với một số mồi đặc trưng ta có.
3.2.1. Mồi OPC4
Kết quả điện di sản phẩm RAPD (hình 3.1) của các dòng giống lúa với mồi OPC4 có từ 5 – 11 phân đoạn được nhân ngẫu nhiên (Bảng 3.1). Trong đó dòng số 5 và dòng số 7 có số phân đoạn được nhân bản nhiều nhất là 11; dòng số 1, 8, 9 có 5 phân đoạn được nhân bản.
Tính đa hình được thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn ADN khi so sánh giữa các giống, dòng với nhaụ ở mồi OPC4 có 12 băng đa hình được nhân lên.
Khóa luận tốt nghiệp
Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD ở 16 giống (dòng) lúa với mồi OPC4
(Các giếng từ trái qua phải tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúa)
Bảng 3.1 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng PCR- RAPD với mồi OPC4
đđn Thứ tự các giống (dòng) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 2 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 5 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 8 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 9 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 10 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 tpđ 5 6 9 9 11 10 11 5 5 9 6 10 7 10 7 8
Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn được nhân của mỗi mẫu; đđn: thứ tự đoạn
Khóa luận tốt nghiệp 3.2.2. Mồi OPC5
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD ở 16 giống (dòng) lúa với mồi OPC5
(Các giếng từ trái qua phải tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúa). Bảng 3.2 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng
PCR – RAPD với mồi OPC5 đđn Thứ tự các giống (dòng) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 2 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 3 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 4 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1` 1 1 1 1 1 5 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 6 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 7 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 8 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 tpđ 3 3 4 3 6 6 4 5 3 6 5 7 3 2 2 3
Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn được nhân của mỗi mẫu; đđn: thứ tự đoạn
Khóa luận tốt nghiệp
Kết quả điện di cho ta từ 2 – 7 băng ADN được nhân lên của 16 giống lúa nghiên cứụ Số băng được nhân lên ở giống số 12 nhiều nhất là 7 băng, giống số 14 và 15 chỉ có 2 băng ADN được nhân ngẫu nhiên.
Tổng số băng ADN được nhân bản của 16 giống lúa với mồi OPC5 là 65 đoạn trong đó có 64 đoạn đa hình và một đoạn đơn hình.
3.2.3. Mồi OPN12
Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR- RAPD ở16 giống (dòng) lúa với mồi OPN12
(Các giếng từ trái qua phải tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúa).
Kết quả điện di sản phẩm RAPD (Hình 3.3) của các giống (dòng) lúa với mồi OPN12 có từ 4 – 12 phân đoạn được nhân ngẫu nhiên và có 13 băng đa hình được nhân lên (Bảng 3.3). Trong đó giống (dòng) số 9 có phân đoạn ADN được nhân nhiều nhất là 10 phân đoạn, 2 giống số 16 và số 4 có 4 phân đoạn được nhân bản. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khóa luận tốt nghiệp
Bảng 3.3 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng PCR – RAPD với mồi OPN12
đđn 1 2 3 4 5 6 Thứ tự các giống (dòng) 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 5 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 7 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 8 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 11 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 13 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 tpđ 6 7 6 4 5 9 6 5 10 7 5 6 9 7 5 4
Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn được nhân của mỗi mẫu; đđn: thứ tự đoạn
được nhân. Số 1: đoạn ADN được nhân, số 0: đoạn ADN không được nhân.
3.2.4. Mồi OPM6
Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR- RAPD ở16 giống (dòng) lúa với mồi OPM6
Khóa luận tốt nghiệp
Bảng 3.4 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng PCR – RAPD với mồi OPM6
đđn 1 2 3 4 5 6 Thứ tự các giống (dòng) 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 2 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 3 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 4 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 5 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 7 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 8 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 9 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 10 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 11 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 tpđ 4 8 9 6 6 7 7 7 6 6 5 4 2 4 7 4
Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn được nhân của mỗi mẫu; đđn: thứ tự đoạn
được nhân Số 1: đoạn ADN được nhân, số 0: đoạn ADN không được nhân. Mồi OPM6 sau khi phân tích điện di PCR_RAPD cho ta 2 – 9 phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên. Có tổng cộng 12 băng ADN đa hình trong đó, giống số 3 cho số băng ADN được nhân ngẫu nhiên cao nhất là 9, thấp nhất là giống số 13 chỉ có 2 băng đa hình được nhân.
Thống kê số lượng các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trên cả 6 mồi PCR_RAPD ta thu được bảng saụ
Bảng 3.5 Tổng số các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên của các mồi đa hình. Tên mồi 1 2 3 4 5 6 Thứ tự các giống (dòng) 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 OPC4 5 6 9 9 11 10 11 5 5 9 6 10 7 10 7 8 OPC5 3 3 4 3 6 6 4 5 3 6 5 7 3 2 2 3 OPC15 4 3 2 4 4 6 6 3 3 3 5 2 3 3 4 2 OPN12 5 3 7 4 6 8 5 6 5 4 2 4 6 7 7 7 OPN17 6 7 6 4 5 9 6 5 10 7 5 6 9 7 5 4 OPM6 4 8 9 6 6 7 7 7 6 6 5 4 2 4 7 4
Khóa luận tốt nghiệp
Nhận xét: Số lượng băng đa hình của 16 giống (dòng) lúa ở mồi OPC4
là cao nhất (128 băng). Thấp nhất là OPC15 (57 băng). Số lượng các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên đối với các mồi theo thứ tự là:
OPC4 (128) > OPN12 (101) > OPM6 (92) > OPN17 (86) > OPC5 (65) > OPC15 (57)
Bảng 3.6 Thống kê các mồi xuất hiện đa hình.
SST Tên mồi Số băng được nhân Số băng đa hình
1 OPC4 12 12 2 OPC5 9 8 3 OPC15 8 8 4 OPN12 13 13 5 OPN17 10 10 6 OPM6 12 12 7 Số mồi đa hình 6 64 63
Nhận xét: các giá trị thống kê ở bảng 3.6 phù hợp với bảng 3.5. Trong các
nghiên cứu tiếp theo cần tìm hiểu giá trị của các mồi trên những đối tượng khác nhau để khẳng định tính đa hình của các mồi trên.
3.3. Mối quan hệ giữa các giống lúa dựa trên phân tích RAPD
Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn ADN của các mẫu điện di sản phẩm RAPD, chúng tôi thiết lập mối liên quan giữa các dòng (giống) lúa ở mức độ phân tử. Mức độ khác nhau được biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các dòng (giống) lúa đột biến. Các dòng có hệ số di truyền cao sẽ được xếp vào một nhóm. Giữa các nhóm lại có sự liên hệ về mức độ giống nhau của hệ số tương đồng di truyền.
Kết quả nhận được trình bày ở bảng 3.7 về mối tương quan di truyền từng cặp và hình 3.5 dưới dạng một sơ đồ hình câỵ
Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.7 Ma trận tương đồng của 16 giống (dòng) lúa đột biến
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 1.00 2 0.45 1.00 3 0.33 0.36 1.00 4 0.50 0.51 0.30 1.00 5 0.46 0.26 0.36 0.44 1.00 6 0.45 0.64 0.38 0.67 0.44 1.00 7 0.55 0.51 0.51 0.55 0.43 0.60 1.00 8 0.41 0.40 0.29 0.52 0.35 0.52 0.53 1.00 9 0.40 0.35 0.23 0.42 0.31 0.42 0.48 0.42 1.00 10 0.35 0.27 0.26 0.35 0.42 0.39 0.30 0.35 0.31 1.00 11 0.48 0.38 0.28 0.53 0.51 0.53 0.50 0.39 0.44 0.37 1.00 12 0.50 0.47 0.33 0.59 0.35 0.55 0.51 0.52 0.36 0.47 0.58 1.00 13 0.45 0.59 0.31 0.66 0.36 0.58 0.59 0.52 0.52 0.33 0.50 0.55 1.00 14 0.55 0.51 0.32 0.55 0.30 0.55 0.56 0.44 0.35 0.38 0.50 0.60 0.55 1.00 15 0.26 0.22 0.47 0.28 0.38 0.36 0.34 0.35 0.20 0.37 0.38 0.39 0.30 0.34 1.00 16 0.31 0.25 0.13 0.25 0.08 0.25 0.36 0.17 0.21 0.06 0.18 0.19 0.19 0.30 0.00 1.00
Chú thích: các số từ 1-16 tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúạ
Coefficient 0.20 0.32 0.44 0.56 0.68 D52N A-20 D52 CL8-1 XH-1 HD-1DB CL-9 XH-3 HD-1LM D51 BT-7 HD-01 HD-02 D53 XH-5 IR-64 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.5 Sơ đồ hình cây của 16 giống (dòng) lúa đột biến
Phân tích bảng 3.7 cho thấy các giống lúa có hệ số tương đồng di truyền từng cặp nằm trong khoảng từ 0,13 – 0,67. Cá biệt giữa 2 giống XH-5 và
Khóa luận tốt nghiệp
IR-64 có mức độ tương đồng 0,00 tức là 2 giống không tương đồng di truyền. Cao nhất là hệ số tương đồng di ruyền giữa 2 giống D52 và giống CL8-1.
Dựa vào sự sai khác về mức độ tương đồng di truyền ở 44% chúng tôi chia sơ đồ hình cây của 16 giống (dòng) lúa đột biến thành 9 nhóm chính:
Nhóm 1: Gồm các dòng (giống) A20, D52, CL8-1, XH-1 có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,40 (1 – 0,60). Được chia thành 2 nhóm phụ
Nhóm phụ 1: Chỉ có dòng (giống) A20.
Nhóm phụ 2: Gồm các dòng (giống) D52, CL8-1, XH-1.
Nhóm 2: Dòng HD-1DB, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,44 (1 – 0,56).
Nhóm 3: Gồm các dòng (giống) CL9 và XH-3, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,46 (1 – 0,54).
Nhóm 4: Dòng HD1-LM, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,53 (1 – 0,47).
Nhóm 5: Dòng (giống) D51 và BT7, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,49 (1 – 0,51).
Nhóm 6: Dòng HD-01, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,58 (1 – 0,42).
Nhóm 7: Dòng HD-01, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,63 (1 – 0,37).
Nhóm 8: Dòng D53 và XH-5, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,67 (1 – 0,33).
Nhóm 9: Dòng (giống) IR-64, có hệ số tương đồng di truyền khác với các dòng còn lại là 0,80 (1 – 0,20).
Khóa luận tốt nghiệp
Kết luận và đề nghị
1. Kết luận
- Đã tách chiết được ADN từ 16 giống (dòng) lúa đột biến nghiên cứu với độ tinh sạch cao, đủ diều kiện để làm phản ứng PCR.
- Đã sử dụng 14 mồi ngẫu nhiên để nghiên cứu đa hình và xác định được 6 mồi cho độ đa hình cao đó là các mồi: OPC4, OPC5, OPC15, OPN12, OPN17, OPM6.
- Xử lý số liệu thu được cho kết quả: đã xác định được mức độ sai khác giữa các dòng, giống lúa nghiên cứu với hệ số tương đồng di truyền nằm trong khoảng 0,13 – 0,67.