4. ý nghĩa lý luận và thực tiễn của công trình
2.4.2. Phương pháp hoá học
Xác định hàm lượng đường bằng đường kế. Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH. Xác định hàm lượng axit bằng phương pháp chuẩn độ.
Xác định hàm lượng cồn bằng cồn kế hoặc bằng phương pháp hoá học. 2.4.3. Phương pháp toán học Gía trị trung bình số học: 1 i n i M M n Trong đó : M : Trung bình tổng thể
Mi: Gá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ 1 n n : Số lần thí nghiệm.
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ Độ lệch chuẩn:
1 2
2 Xi M
Trong đó: Xi: Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ 1 n M : Trung bình tổng thể
: Độ lệch chuẩn.
Hệ số biến thiên của trung bình tổng thể: v .100
M
C (%)
Cv : Hệ số biến thiên của trung bình tổng thể M : Trung bình tổng thể
: Độ lệch chuẩn.
2.5. Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiaẹ Tuyển chọn trên đối tượng là quả táo mèo, dâu và mơ.
2.6. Địa điểm thực hiện đề tài
Phòng thí nghiệm vi sinh , khoa SINH-KTNN Trường ĐHSPHN 2.
2.7. Thời gian thực hiện đề tàị
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ Chương 3
kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Thành phần hoá học của táo mèo, dâu và mơ
Tôi tiến hành nghiên cứu thành phần hoá học của quả táo mèo , dâu và mơ , kết quả được dẫn ra ở bảng 3.1 [3], [5].
Bảng 3.1. Thành phần hoá học của táo mèo, dâu và mơ
Tên quả Thành phần hoá học
Nước Đường Axit tổng số pectin Talin Táo mèo 84,0 4,8 1,54 - - Dâu 84,71 9,19 0,49 0,31 0,035 Mơ 73,8 9,0 1,1 - -
Qua bảng trên tôi thấy các chỉ tiêu về hàm lượng đường, axit tổng số, nước của 3 loại quả đều phù hợp để sử dụng lên men vang. Do vậy, tôi tiến hành nghiên cứu việc lên men vang phối hợp của các loại quả trên.
3.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo, dâu và mơ mèo, dâu và mơ
Tác nhân chính để thực hiện việc chuyển hoá đường thành rượu là nấm men. Vì vậy, để có được chủng nấm men tốt nhất chúng ta cần phải tuyển chọn.
3.2.1. Tiêu chuẩn chọn chủng [6]
Nấm men được chọn phải đạt được các tiêu chuẩn như: Lên men tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao; Chịu được độ cồn và độ axit cao; Tốc độ phát triển nhanh, chu kì lên men ngắn; Hương thơm đặc trưng không có vị lạ, không sinh độc tố; Dễ lắng trong; Khả năng cạnh tranh tốt với các vi sinh vật khác, ổn định lâu dài trong sản xuất.
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ Khi đã có dịch siro của từng loại quả riêng biệt để chọn tỉ lệ phối hợp phù hợp nhất, tôi tiến hành phối hợp các nguyên liệu theo tỉ lệ được dẫn ra ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tỉ lệ phối hợp nguyên liệu
Mẫu TN
Nguồn nguyên liệu phối hợp (%)
Mẫu TN
Nguồn nguyên liệu phối hợp (%)
Táo
mèo Dâu Mơ
Tổng số
Táo
mèo Dâu Mơ Tổng số
1 80 10 10 100 16 10 70 20 100 2 70 20 10 100 17 10 60 30 100 3 60 30 10 100 18 10 50 40 100 4 50 40 10 100 19 10 40 50 100 5 40 50 10 100 20 10 30 60 100 6 30 60 10 100 21 10 20 70 100 7 20 70 10 100 22 50 30 20 100 8 10 80 10 100 23 50 20 30 100 9 10 10 80 100 24 20 50 30 100 10 20 10 70 100 25 30 50 20 100 11 30 10 60 100 26 20 30 50 100 12 40 10 50 100 27 30 20 50 100 13 50 10 40 100 28 60 20 20 100 14 60 10 30 100 29 20 60 20 100 15 70 10 20 100 30 20 20 60 100
Tôi đã tiến hành phân lập các tỉ lệ, sau đó so sánh khuẩn lạc của từng mẫu đồng thời làm tiêu bản quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vị Trong 30 mẫu thí nghiệm trên tôi đã chọn được hai mẫu có kích thước khuẩn lạc to,
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ trơn, nhẵn, bóng, sáng, tế bào nấm men tròn và đều để nghiên cứu tiếp. Hai mẫu nấm men này tạm thời được gọi là TD5, TD7
Mẫu TN Tỉ lệ nguồn nguyên liệu phối hợp (%)
Táo mèo Dâu Mơ
TD5 50 30 20 TD7 70 10 20
Một số hình ảnh của hai chủng nấm men:
Chủng TD5
Chủng TD7
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ
Chủng TD5 Chủng TD7
Hình 3.2. Tế bào nấm men của hai chủng trên kính hiển vi quang học
Chủng TD5 Chủng TD7 Hình 3.3. Khuẩn lạc của chủng nấm men TD5 và TD7
3.3. Tuyển chọn chủng nấm men lên men vang táo mèo, dâu và mơ
3.3.1. Xác định hoạt lực lên men
Hoạt lực lên men được đánh giá bằng hàm lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men . Lượng CO2 sinh ra càng nhiều, thoát ra ngoài môi trường thì trọng lượng bình lên men giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Tôi tiến hành xác định hoạt lực lên men của 2 chủng TD5 và TD7 với số lần nhắc lại là 8 lần trong 72h, kết quả được dẫn ra ở bảng 3.3
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ Bảng 3.3. Hàm lượng CO2 giải phóng sau 72h lên men của 2 chủng nấm
men Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7 Tên chủng Hàm lượng CO2 (g/100ml) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TD5 2,0 2,2 2,1 2,3 2,2 2,4 2,1 2,1 TD7 2,2 3,3 2,1 2,4 2,5 2,2 2,2 2,1
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng TD5 và TD7 lên men đều mạnh, lượng CO2 thoát ra nhiều phủ kín bình lên men. Chính vì vậy, môi trường lên men ít bị nhiễn khuẩn do sự phát triển của tế bào nấm men làm cho vi khuẩn khó phát triển, tạo cồn và hạn chế nấm men dại phát triển, nên tôi quyết định giữ hai chủng làm đối tượng nghiên cứu tiếp.
Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao
Để thử khả năng lên men ở hàm lượng đường cao, tôi tiến hành cho hai chủng lên men trong môi trường dịch siro hỗn hợp có hàm lượng đường 240g/l. Đây là hàm lượng đường thường được dùng cho lên men rượu vang của các loại quả [6]; pH = 4, nhiệt độ 28-300C, số lượng giống ban đầu 3,4. 106tb/ml. Sau khi kết thúc quá trình lên men rượu (15-17 ngày) tôi tiến hành phân tích một số chỉ tiêu hoá lý để xác định khả năng lên men của hai chủng, kết quả được dẫn ra ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao Chỉ tiêu đánh giá Đơn
Vị Chủng nấm men TD5 TD7 Đường tổng số g/l 72 75 Đường khử g/l 0,7 0,72 Độ cồn %V 9,8 9,75
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ Qua bảng ta thấy cả hai chủng có hiệu suất lên men ở hàm lượng đường cao gần như nhaụ
3.3.3. Khả năng kết lắng của hai chủng nấm men
Hoà sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút và để lắng 10 phút tôi thu được kết quả:
Chủng TD5 có chiều cao sinh khối 16 (mm) Chủng TD7 có chiều cao sinh khối 17,5 (mm).
3.3.4. Nghiên cứu động thái phát triển của hai chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7 trong môi trường nhân giống Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7 trong môi trường nhân giống
Giai đọan nhân giống chiếm một thời gian ngắn 24-28h nhưng lại có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sản xuất rượu vang, giai đoạn này làm tăng nhanh số lượng của tế bào nấm men và giúp ta chọn được nấm men có chất lượng tốt nhất ( tế bào trẻ và nảy chồi nhiều nhất) để đáp ứng cho quá trình lên men vang. Tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường số 2 ở điều kiện nhiệt độ 280C, số lượng tế bào ban đầu là 3,4.106tb/ml. Sau 4h
kiểm tra một lần, kết quả nghiên cứu được biểu diễn ở hình 3.4
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn động thái phát triển của hai chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7 trong môi trường nhân giống
SLTB x106tb/ml 0 50 100 150 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Thời gian (h) SLTB-TD5 SLTB-TD7
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ
Qua đồ thị cho ta thấy hai chủng phát triển tốt trong môi trường nhân
giống. Trong 4h đầu chúng tăng chậm, sau 12-16h chúng tăng nhanh và ở 20h số lượng tế bào đạt tối đa 125.106-135.106 tế bàọ Sau 24h-32h số lượng tế bào giảm dần. Vì vậy tôi quyết định chọn thời điểm 20h là thời điểm nhân giống thích hợp. Vì giai đoạn này cả hai chủng TD5 và TD7 đều đang ở giai đoạn logarit [6], [7].
3.3.5. Xác định tên khoa học của hai mẫu nấm men TD5 và TD7
Dựa vào khoá phân loại của Lođer (1972). Theo khoá phân loại này cả hai mẫu nấm men nghiên cứu có đặc tính [6]: Sinh sản nảy chồi nhiều phía; Tế bào hình trứng, hình ovan, hình cầu; Không đồng hoá nitrat; Lên men glucoza mạnh, lên men được hầu hết các loại đường saccaroza, galactoza, mantoza; Điều kiện lên men không thuận lợi hình thành 1- 4 bào tử; Mỗi nang chứa2- 4 bào tử.
Từ đó tôi xác định tên khoa học của 2 mẫu nấm men là Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7.
3.4. ảnh hưởng của một số nhân tố trong quá trình nhân giống
Việc nghiên cứu ảnh hưởng của một số nhân tố trong quá trình nhân giống là để tìm điều kiện phù hợp với những đặc tính sinh học của chủng nấm men, để trong một thời gian nhất định nấm men có thể đạt số lượng tế bào nhiều nhất với chất lượng tốt nhất. Trong công trình nghiên cứu này tôi nghiên cứu các yếu tố như: ảnh hưởng của độ pH, ảnh hưởng của hàm lượng đường. 3.4.1. ảnh hưởng của pH đến quá trình nhân giống
Tôi tiến hành cấy chủng nấm men TD5, TD7 vào môi trường nhân giống với số lượng tế bào ban đầu là 3,4.106 tb/ml, ở nhiệt độ 24-280C . Độ pH thay đổi ở các mức 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5. kết quả thí nghiệm được dẫn ra ở hình 3.5.
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ
hình 3.5. biểu đồ biểu diễn số lượng tế bào trung bình sau 28 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau
Như vậy, qua biểu đồ ta thấy số lượng tế bào nấm men đạt giá trị lớn nhất ở pH = 4,0 – 4,5. Đối với các giá trị pH lớn hơn 4,5 thì số lượng tế bào nấm men giảm mạnh do sự nhiễm khuẩn hạn chế sự phát triển của tế bào nấm men. Đối với các giá trị pH nhỏ hơn 4,0 thì tế bào nấm men cũng phát triển chậm. Do vậy, để hạn chế sự phát triển của yếu tố tạp nhiễm để tạo điều kiện phát triển cao nhất của tế bào nấm men tôi chọn pH thích hợp cho quá trình lên men của 2 chủng TD5, TD7 là 4,0 - 4,5. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả Nguyễn Thuý Bạch, Vũ Thanh Thuỷ, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh [1], [8].
3.4.2. ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống
Cacbon giúp tế bào nấm men tạo sinh khối tế bào, nguồn cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, enzym, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Trong quá trình nhân giống đường giúp tế bào nấm men chứ không dùng trong quá trình lên men rượụ Do đó trong quá trình nhân giống thì không cần nhiều đường như quá trình lên men rượu vang. Để xác định hàm lượng đường thích hợp cho quá trình nhân giống, tôi tiến hành thí nghiệm trên môi trường
Độ pH 0 10 20 30 40 50 60 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 SLTB-TD5 SLTB-TD7 SLTBx106tb/m
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ nhân giống ở nhiệt độ 24 - 280C, pH = 4, hàm lượng đường thay đổi ở các mức 6%, 8%,10%, 12%, 14%, 16% kết quả thí nghiệm diễn ra ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống của 2 chủng nấm men TD5, TD7 (24h) Hàm lượng đường (%) 6% 8% 10% 12% 14% 16% SLTB - TD5 (M.106tb/ml 105 ± 4 117 ± 3 124 ± 4 132 ± 5 119 ± 3 115 ± 4 SLTB – TD7 M.106tb/ml 115 ± 3 126 ± 4 138 ± 3 153 ± 4 125 ± 4 116 ± 3 Qua bảng 3.6. ta thấy cả 2 chủng nấm men đều có số lượng tế bào tăng dần từ hàm lượng đường 6%- 12%, nhưng ở hàm lượng đường từ 14% - 16% thì số lượng tế bào lại giảm. Số lượng tế bào đạt giá trị cao nhất là ở hàm lượng đường 12% (132.106 – 153.106tb/ml). Do vậy tôi quyết định chọn hàm lượng đường thích hợp cho quá trình nhân giống của hai chủng nấm men TD5,TD7 là 12%.
3.5. ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường dinh dưỡng đến sự phát
triển của hai chủng nấm men TD5, TD7 trong môi trường lên men
Môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của nấm men, chỉ cần biết đổi một yếu tố nào đó trong môi trường dinh dưỡng ở một phạm vi nhất định sẽ ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men.
3.5.1. Động thái lên men vang táo mèo, dâu và mơ
Tôi tiến hành lên men ở quy mô thí nghiệm trong các bình lên men có dung tích 1l. Môi trường lên men là môi trường 3, hàm lượng đường 200g/l, hàm lượng giống 12%, pH = 4,0, nhiệt độ 24-280C, số lượng giống ban đầu là 3,4.106 tb/ml. Tiến hành phân tích mẫu mỗi ngày một lần trong 15 ngày liên tục. Tôi thu được kết quả thông qua hình 3.5, hình 3.6 và hình 3.7.
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễnsự biến thiên hàm lượng đường và hàm lượng cồn của chủng nấm men TD7
hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hàm lượng đường và hàm
lượng cồn của chủng TD5 0 5 10 15 20 25
Thời gian (ngày)
0 5 10 15 HL cồn-TD7 HL đường – TD7 0 5 10 15 20 25
Thời gian (ngày)
0 5 10 15
HL cồn-TD5
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên số lượng tế bào của chủng TD5 và TD7
Qua đồ thị cho thấy hai chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae sinh sản nhanh vào ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 tương ứng đây là pha logarit và duy trì ổn định trong ngày thứ 6 đến ngày thứ 9, đây chính là pha cân bằng. Từ ngày thứ 10 trở đi số lượng tế bào nấm men giảm dần tương ứng với pha suy vong, lúc này số lượng tế bào nấm men đạt khoảng 135.106
tb/ml-142.106 tb/ml.
Điều này được giải thích: do ở ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 môi trường có nhiều dinh dưỡng, hàm lượng cồn còn thấp chưa có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm men. Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 môi trường vẫn còn đủ dinh dưỡng để duy trì số lượng tế bào nấm men, nhưng ngày thứ 10 trở đi hàm lượng cồn tăng nhanh, hàm lượng đường giảm mạnh, đặc biệt là sự cạn kiệt nguồn đạm đã làm cho tế bào nấm men bị tự phân và lắng xuống đáy bình nên số lượng tế bào giảm nhanh. Cùng với sự biến đổi của tế bào nấm men thì độ cồn tăng dần, hàm lượng đường giảm do đường chuyển thành rượụ Ngoài ra một lượng đường chuyển hoá thành axit hữu cơ
Ngày 0 50 100 150 200 250 0 5 10 15 SLTB-TD5 SLTB-TD7 SLTBx 106tb/ml
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ để duy trì hoạt động sống của tế bào nấm men. Do vậy, hàm lượng axit tổng số tăng dần tuy nhiên không lớn lắm.
3.5.2. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men vang táo mèo , dâu và mơ
3.5.2.1. ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men