4. ý nghĩa lý luận và thực tiễn của công trình
3.3. Tuyển chọn chủng nấm men lên men vang táo mèo, dâu và mơ
3.3.1. Xác định hoạt lực lên men
Hoạt lực lên men được đánh giá bằng hàm lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men . Lượng CO2 sinh ra càng nhiều, thoát ra ngoài môi trường thì trọng lượng bình lên men giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Tôi tiến hành xác định hoạt lực lên men của 2 chủng TD5 và TD7 với số lần nhắc lại là 8 lần trong 72h, kết quả được dẫn ra ở bảng 3.3
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ Bảng 3.3. Hàm lượng CO2 giải phóng sau 72h lên men của 2 chủng nấm
men Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7 Tên chủng Hàm lượng CO2 (g/100ml) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TD5 2,0 2,2 2,1 2,3 2,2 2,4 2,1 2,1 TD7 2,2 3,3 2,1 2,4 2,5 2,2 2,2 2,1
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng TD5 và TD7 lên men đều mạnh, lượng CO2 thoát ra nhiều phủ kín bình lên men. Chính vì vậy, môi trường lên men ít bị nhiễn khuẩn do sự phát triển của tế bào nấm men làm cho vi khuẩn khó phát triển, tạo cồn và hạn chế nấm men dại phát triển, nên tôi quyết định giữ hai chủng làm đối tượng nghiên cứu tiếp.
Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao
Để thử khả năng lên men ở hàm lượng đường cao, tôi tiến hành cho hai chủng lên men trong môi trường dịch siro hỗn hợp có hàm lượng đường 240g/l. Đây là hàm lượng đường thường được dùng cho lên men rượu vang của các loại quả [6]; pH = 4, nhiệt độ 28-300C, số lượng giống ban đầu 3,4. 106tb/ml. Sau khi kết thúc quá trình lên men rượu (15-17 ngày) tôi tiến hành phân tích một số chỉ tiêu hoá lý để xác định khả năng lên men của hai chủng, kết quả được dẫn ra ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao Chỉ tiêu đánh giá Đơn
Vị Chủng nấm men TD5 TD7 Đường tổng số g/l 72 75 Đường khử g/l 0,7 0,72 Độ cồn %V 9,8 9,75
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ Qua bảng ta thấy cả hai chủng có hiệu suất lên men ở hàm lượng đường cao gần như nhaụ
3.3.3. Khả năng kết lắng của hai chủng nấm men
Hoà sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút và để lắng 10 phút tôi thu được kết quả:
Chủng TD5 có chiều cao sinh khối 16 (mm) Chủng TD7 có chiều cao sinh khối 17,5 (mm).
3.3.4. Nghiên cứu động thái phát triển của hai chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7 trong môi trường nhân giống Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7 trong môi trường nhân giống
Giai đọan nhân giống chiếm một thời gian ngắn 24-28h nhưng lại có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sản xuất rượu vang, giai đoạn này làm tăng nhanh số lượng của tế bào nấm men và giúp ta chọn được nấm men có chất lượng tốt nhất ( tế bào trẻ và nảy chồi nhiều nhất) để đáp ứng cho quá trình lên men vang. Tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường số 2 ở điều kiện nhiệt độ 280C, số lượng tế bào ban đầu là 3,4.106tb/ml. Sau 4h
kiểm tra một lần, kết quả nghiên cứu được biểu diễn ở hình 3.4
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn động thái phát triển của hai chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7 trong môi trường nhân giống
SLTB x106tb/ml 0 50 100 150 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Thời gian (h) SLTB-TD5 SLTB-TD7
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ
Qua đồ thị cho ta thấy hai chủng phát triển tốt trong môi trường nhân
giống. Trong 4h đầu chúng tăng chậm, sau 12-16h chúng tăng nhanh và ở 20h số lượng tế bào đạt tối đa 125.106-135.106 tế bàọ Sau 24h-32h số lượng tế bào giảm dần. Vì vậy tôi quyết định chọn thời điểm 20h là thời điểm nhân giống thích hợp. Vì giai đoạn này cả hai chủng TD5 và TD7 đều đang ở giai đoạn logarit [6], [7].
3.3.5. Xác định tên khoa học của hai mẫu nấm men TD5 và TD7
Dựa vào khoá phân loại của Lođer (1972). Theo khoá phân loại này cả hai mẫu nấm men nghiên cứu có đặc tính [6]: Sinh sản nảy chồi nhiều phía; Tế bào hình trứng, hình ovan, hình cầu; Không đồng hoá nitrat; Lên men glucoza mạnh, lên men được hầu hết các loại đường saccaroza, galactoza, mantoza; Điều kiện lên men không thuận lợi hình thành 1- 4 bào tử; Mỗi nang chứa2- 4 bào tử.
Từ đó tôi xác định tên khoa học của 2 mẫu nấm men là Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7.
3.4. ảnh hưởng của một số nhân tố trong quá trình nhân giống
Việc nghiên cứu ảnh hưởng của một số nhân tố trong quá trình nhân giống là để tìm điều kiện phù hợp với những đặc tính sinh học của chủng nấm men, để trong một thời gian nhất định nấm men có thể đạt số lượng tế bào nhiều nhất với chất lượng tốt nhất. Trong công trình nghiên cứu này tôi nghiên cứu các yếu tố như: ảnh hưởng của độ pH, ảnh hưởng của hàm lượng đường. 3.4.1. ảnh hưởng của pH đến quá trình nhân giống
Tôi tiến hành cấy chủng nấm men TD5, TD7 vào môi trường nhân giống với số lượng tế bào ban đầu là 3,4.106 tb/ml, ở nhiệt độ 24-280C . Độ pH thay đổi ở các mức 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5. kết quả thí nghiệm được dẫn ra ở hình 3.5.
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ
hình 3.5. biểu đồ biểu diễn số lượng tế bào trung bình sau 28 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau
Như vậy, qua biểu đồ ta thấy số lượng tế bào nấm men đạt giá trị lớn nhất ở pH = 4,0 – 4,5. Đối với các giá trị pH lớn hơn 4,5 thì số lượng tế bào nấm men giảm mạnh do sự nhiễm khuẩn hạn chế sự phát triển của tế bào nấm men. Đối với các giá trị pH nhỏ hơn 4,0 thì tế bào nấm men cũng phát triển chậm. Do vậy, để hạn chế sự phát triển của yếu tố tạp nhiễm để tạo điều kiện phát triển cao nhất của tế bào nấm men tôi chọn pH thích hợp cho quá trình lên men của 2 chủng TD5, TD7 là 4,0 - 4,5. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả Nguyễn Thuý Bạch, Vũ Thanh Thuỷ, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh [1], [8].
3.4.2. ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống
Cacbon giúp tế bào nấm men tạo sinh khối tế bào, nguồn cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, enzym, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Trong quá trình nhân giống đường giúp tế bào nấm men chứ không dùng trong quá trình lên men rượụ Do đó trong quá trình nhân giống thì không cần nhiều đường như quá trình lên men rượu vang. Để xác định hàm lượng đường thích hợp cho quá trình nhân giống, tôi tiến hành thí nghiệm trên môi trường
Độ pH 0 10 20 30 40 50 60 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 SLTB-TD5 SLTB-TD7 SLTBx106tb/m
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ nhân giống ở nhiệt độ 24 - 280C, pH = 4, hàm lượng đường thay đổi ở các mức 6%, 8%,10%, 12%, 14%, 16% kết quả thí nghiệm diễn ra ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống của 2 chủng nấm men TD5, TD7 (24h) Hàm lượng đường (%) 6% 8% 10% 12% 14% 16% SLTB - TD5 (M.106tb/ml 105 ± 4 117 ± 3 124 ± 4 132 ± 5 119 ± 3 115 ± 4 SLTB – TD7 M.106tb/ml 115 ± 3 126 ± 4 138 ± 3 153 ± 4 125 ± 4 116 ± 3 Qua bảng 3.6. ta thấy cả 2 chủng nấm men đều có số lượng tế bào tăng dần từ hàm lượng đường 6%- 12%, nhưng ở hàm lượng đường từ 14% - 16% thì số lượng tế bào lại giảm. Số lượng tế bào đạt giá trị cao nhất là ở hàm lượng đường 12% (132.106 – 153.106tb/ml). Do vậy tôi quyết định chọn hàm lượng đường thích hợp cho quá trình nhân giống của hai chủng nấm men TD5,TD7 là 12%.
3.5. ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường dinh dưỡng đến sự phát
triển của hai chủng nấm men TD5, TD7 trong môi trường lên men
Môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của nấm men, chỉ cần biết đổi một yếu tố nào đó trong môi trường dinh dưỡng ở một phạm vi nhất định sẽ ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men.
3.5.1. Động thái lên men vang táo mèo, dâu và mơ
Tôi tiến hành lên men ở quy mô thí nghiệm trong các bình lên men có dung tích 1l. Môi trường lên men là môi trường 3, hàm lượng đường 200g/l, hàm lượng giống 12%, pH = 4,0, nhiệt độ 24-280C, số lượng giống ban đầu là 3,4.106 tb/ml. Tiến hành phân tích mẫu mỗi ngày một lần trong 15 ngày liên tục. Tôi thu được kết quả thông qua hình 3.5, hình 3.6 và hình 3.7.
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễnsự biến thiên hàm lượng đường và hàm lượng cồn của chủng nấm men TD7
hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hàm lượng đường và hàm
lượng cồn của chủng TD5 0 5 10 15 20 25
Thời gian (ngày)
0 5 10 15 HL cồn-TD7 HL đường – TD7 0 5 10 15 20 25
Thời gian (ngày)
0 5 10 15
HL cồn-TD5
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên số lượng tế bào của chủng TD5 và TD7
Qua đồ thị cho thấy hai chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae sinh sản nhanh vào ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 tương ứng đây là pha logarit và duy trì ổn định trong ngày thứ 6 đến ngày thứ 9, đây chính là pha cân bằng. Từ ngày thứ 10 trở đi số lượng tế bào nấm men giảm dần tương ứng với pha suy vong, lúc này số lượng tế bào nấm men đạt khoảng 135.106
tb/ml-142.106 tb/ml.
Điều này được giải thích: do ở ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 môi trường có nhiều dinh dưỡng, hàm lượng cồn còn thấp chưa có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm men. Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 môi trường vẫn còn đủ dinh dưỡng để duy trì số lượng tế bào nấm men, nhưng ngày thứ 10 trở đi hàm lượng cồn tăng nhanh, hàm lượng đường giảm mạnh, đặc biệt là sự cạn kiệt nguồn đạm đã làm cho tế bào nấm men bị tự phân và lắng xuống đáy bình nên số lượng tế bào giảm nhanh. Cùng với sự biến đổi của tế bào nấm men thì độ cồn tăng dần, hàm lượng đường giảm do đường chuyển thành rượụ Ngoài ra một lượng đường chuyển hoá thành axit hữu cơ
Ngày 0 50 100 150 200 250 0 5 10 15 SLTB-TD5 SLTB-TD7 SLTBx 106tb/ml
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ để duy trì hoạt động sống của tế bào nấm men. Do vậy, hàm lượng axit tổng số tăng dần tuy nhiên không lớn lắm.
3.5.2. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men vang táo mèo , dâu và mơ
3.5.2.1. ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men
Độ pH không chỉ ảnh hưởng tới khả năng sinh sản và phát triển của tế bào nấm men mà còn ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của vang. Để nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH ban đầu tôi tiến hành thí nghiệm trên môi trường số 3 với hàm lượng đường 200g/l, nhiệt độ 24-280C, pH thay đổi ở các mức : 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; thu được kết quả ở bảng 3.7 và bảng 3.8.
Bảng 3.7. ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae TD5
Chỉ tiêu phân tích Đơn vị pH 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
Thời gian lên men h 100 -110 87-95 83-95 82-90 80-86
HL đường sót g/l 5,6 ± 0.2 5,3 ± 0,2 4,5 ±0,2 4,8 ± 0,2 5,9 ± 0,2
Hàm lượng cồn %V 10,2 ± 0,1 115± 0,2 12,5±0,1 11.8±0,1 9,7 ± 0,1
Bảng 3.8. ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae TD7
Chỉ tiêu phân tích Đơn vị
pH
3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
Thời gian lên men h 100-110 84-95 82-92 78-90 76-86
HL đường sót g/l 5,4 ± 0.2 5,0 ± 0,2 4,2 ±0,2 4,7 ± 0,2 5,6 ± 0,2
Hàm lượng cồn %V 11,2 ± 0,1 11,9±0,2 13 ± 0,1 12,5±0,1 9,5± 0,1
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ
Kết quả nghiên cứu cho thấy khi pH tăng thì thời gian lên men giảm. trong đó ở pH = 4,0- 4,5 thời gian lên men lâu hơn nhưng lại có hàm lượng đường sót thấp (4,2-4,8g/l) và hàm lượng cồn cao (11,8- 13,0 %V) nên hiệu suất lên men caọ Đối với mẫu pH = 3,0- 3,5 có hiệu suất lên men giảm ( hàm lượng cồn 10,2- 11,9%V) do khi hàm lượng axit tăng ( độ pH thấp) thì áp suất thẩm thấu tăng có thể sẽ gây ức chế các hoạt động sống của nấm men. Đối với mẫu có pH = 5,0 có hàm lượng đường sót cao ( 5,6- 5,9g/l) và hàm lượng cồn thấp (9,5- 9,7%V) thì vị ngọt dư thừa nên không phù hợp thị hiếu người tiêu dùng.
Như vậy, độ pH thích hợp cho lên men vang táo mèo, dâu và mơ là: 4,0 – 4,5. với kết quả thu được tôi nhận thấy cả hai chủng nấm men TD5 và TD7 đều lên men ở độ pH thích hợp cho nấm men nói chung và kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung [7], [8].
3.5.2.2. ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình lên men. Chính vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang phối hợp táo mèo, dâu và mơ nhằm tìm nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men này để nâng cao chất lượng của vang.
Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường lên men (MT3) số lượng giống ban đầu là 3,4 .106tb/ml , pH = 4,0, nhiệt độ thay đổi từ 200 , 240 , 280 , 320. Theo dõi liên tục trong 10 ngày, kết quả được dẫn ra ở bảng 3.9 và bảng 3.10.
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ Bảng 3.9. ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men của chủng nấm
men Saccharomyces cerevisiae TD5 Chỉ tiêu phân tích Đơn
vị Nhiệt độ (
0C)
200 240 280 320
Thời gian lên men Ngày 10 10 10 10 HL đường sót g/l 6,1± 0,2 5,7 ± 0,5 5,2 ± 0,2 7,2 ± 0,3 Hàm lượng cồn %V 8,8 ± 1,1 10,2±1,3 12,8 ± 1,1 8,5 ± 1,2 Axit tổng số g/l 5,7 ± 0,2 6,1 ± 0,2 6,3 ± 0,1 5,5 ± 0.2 pH 4,35 4,2 4,1 4,5
Bảng 3.10. ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae TD7
Chỉ tiêu phân tích Đơn vị
Nhiệt độ (0C)
200 240 280 320
Thời gian lên men Ngày 10 10 10 10 HL đường sót g/l 6,2 ±0,2 5,5 ± 0,2 5,25±0,2 7,5 ± 0,3 Hàm lượng cồn %V 8,6 ± 1,1 11,2 ± 1,3 12,5±1,1 8,3 ± 1,2 Axit tổng số g/l 5,6 ± 0,2 6,25 ± 0,2 6,27±0,1 5,3 ± 0.2 pH 4,3 4,1 4,0 4,6
Qua bảng ta thấy khi nhiệt độ tăng từ 200- 280 thì hàm lượng rượu sinh ra cũng tăng từ 8,6%- 12,8% cùng với hàm lượng rượu tăng là hàm lượng đường sót giảm ( 5,2g/l- 7,5g/l). Đặc biệt khi ở nhiệt độ này thì giá trị cảm quan tốt, nói cách khác nhiệt độ ảnh hưởng tới quá trình lên men và các hợp chất hình thành. Do vậy, có thể nói nhiệt độ là yếu tố quan trọng quyết định chất lượng rượu vang.
Mẫu có hàm lượng rượu tạo ra lớn và chất lượng cảm quan tốt nhất là mẫu lên men ở 280C . Mẫu có hiệu suất lên men và giá trị cảm quan thấp nhất
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Huệ là mẫu lên men ở 320. Do ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động sống của nấm men, sự thoát CO2 mạnh làm cho sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây hỏng vang, đồng thời làm cho hàm lượng cồn bị hao hụt tăng lên, các sản phẩm trung gian (axetalđêhyt, axeton…) cũng được tạo ra nhiều hơn đã làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm.