Tiến hành lấy 2ml máu tĩnh mạch của từng người tham gia nghiên cứu, chống đông bằng EDTA.
Yêu cầu:
o Quy trình đảm bảo tuyệt đối vô trùng.
o Máu không được đông, không được vỡ hồng cầu.
o Mẫu DNA tách chiết cần được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (-20 C) cho đến khi phân tích mẫu.
2.4.2. Quy trình tách chiết DNA và kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch 2.4.2.1. Quy trình tách chiết DNA
DNA được tách chiết theo phương pháp PCI (Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol)
Bước 1: Phá vỡ hồng cầu.
Cho vào ống Eppendorf (loại 1,5ml) 0,5ml máu toàn phần và 1ml Lysis Buffer RBC.
Lắc nhẹ, vortex, để 5 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Loại dịch nổi, thu cặn.
Lặp lại bước này 2 lần hoặc nhiều hơn cho đến khi thấy tủa trắng và dung dịch tương đối trong.
Bước 2: Phá vỡ màng bạch cầu.
Thêm 1ml dung dịch PBS, lắc nhẹ. PBS (phosphate buffer saline) là dung dịch đệm, ổn định pH môi trường 7,4.
Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Loại dịch nổi, thu cặn.
Thêm 600µl dung dịch Lysis Buffer HD, 15µl Proteinase K.
Ủ 56oC/1h (hoặc cho đến khi tan hết cặn thành dung dịch đồng nhất).
Bước 3: Loại bỏ tạp chất khác và tủa DNA.
Thêm 500µl dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (PCI), tỷ lệ 25:24:1 để tủa protein.
Trộn đều và ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Hỗn hợp phân thành 2 lớp, quan sát thấy một lớp màng trắng, nhầy phân tách giữa 2 lớp. Ta thu lớp trên trong suốt.
Thêm 500µl dung dịch Chloroform : Isoamylalcohol (CI), tỷ lệ 24:1.
Lắc trộn đều, ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Thu lớp trên trong suốt.
Thêm 2,5V Ethanol 100% (1000µl) và 0,1V CH3COONa 3M (40µl). Lắc đều, để ở -20oC trong 2h.
Ly tâm 15000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC thu tủa. Thêm 1ml Ethanol 70%, trộn đều.
Ly tâm 15000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC thu được tủa DNA. Thu tủa DNA, để khô, hòa tan bằng 60µl TE.
2.4.2.2. Quy trình kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA
DNA sau khi tách chiết được đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang.
Nguyên lý:
Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base purin và pyrimidin, hai loại đơn phân cấu tạo nên DNA mà giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu.
Protein có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 280nm do có sự hấp thụ ánh sáng của các acid amin nhân thơm và dị vòng (tryptophan, phenylalanine). Ngoài ra protein cũng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm như các acid nucleic do đó làm sai lệch giá trị đúng của acid nucleic. Carbohydrat có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 230nm. Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm và OD260nm/OD230nm để kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết.
Mẫu DNA đạt yêu cầu tốt nhất khi: Nồng độ DNA > 50 ng/µL.
OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2. OD260nm/OD230nm > 2. Cách tiến hành:
Khởi động phần mềm trên máy tính. Chọn “Nucleic acid”.
Mở nắp máy Nanodrop, hút 2µl dung dịch pha loãng DNA (TE hoặc DNA Rehydration Solution) cho vào vị trí đo. Đậy nắp, nhấn vào “Blank” (hoặc phím F3) để trắng.
Hút 2µl dung dịch DNA cho vào vị trí đo đã lau sạch, nhấn “Measure” (hoặc phím F1) để đo nồng độ của mẫu DNA.
Ghi lại kết quả và xem xét có đạt yêu cầu hay không.
2.4.3. Quy trình khuếch đại DNA và điện di kiểm tra sản phẩm 2.4.3.1. Quy trình khuếch đại DNA (PCR)
Thành phần phản ứng PCR:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước cất 2 lần 4
3 Mồi xuôi (2,5 pmol/µl) 1
4 Mồi ngược (2,5 pmol/µl) 1
5 DNA 1,5
Tổng thể tích 15
Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Hình 2.10. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Sản phẩm khuếch đại nhờ cặp mồi nói trên có kích thước 509bp chứa SNP rs25487.
2.4.3.2. Quy trình điện di sản phẩm PCR
Chuẩn bị gel agarose 1,5%:
Hòa tan 0,375g bột agarose trong 25ml TBE 1X.
Đun hỗn hợp bằng lò vi sóng đến khi thành dung dịch đồng nhất. Đổ gel vào khay điện di đã có sẵn lược để tạo giếng.
Để gel đông đặc hoàn toàn trong 40-60 phút
Cho bản gel vào bể điện di đã có sẵn dung dịch TBE 1X. Tra mẫu điện di:
Tra 2µl Marker 100bp vào 1 giếng.
Tra 4µl sản phẩm PCR lần lượt vào các giếng còn lại. Chạy điện di:
Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 120V trong vòng 20 phút. Nhuộm bản gel đã điện di:
Ngâm bản gel điện di vào dung dịch Ethidium Bromide 5 mg/mL trong 5-7 phút.
Rửa bản gel bằng nước để loại bỏ Ethidium Bromide dư cũng như cặn bẩn. Chụp ảnh gel: Bản gel sau khi nhuộm với Ethidium Bromide được soi bằng
tia tử ngoại. Quan sát các băng DNA xuất hiện trên bản gel và thực hiện chụp lưu giữ kết quả. Với cặp mồi được thiết kế thì sản phẩm PCR thu được sẽ có kích thước 509bp. 94ºC 94ºC 5 phút 30 giây 72ºC 72ºC 5 phút 30 giây 59ºC 30 giây 40 chu kỳ ∞ 15ºC