Giải trình tự gen là tìm ra trình tự sắp xếp của các nucleotide trên đoạn gen được quan tâm [69]. Có 3 phương pháp giải trình tự cơ bản là phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert, phương pháp enzym của Sanger và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động. Kỹ thuật giải trình tự gen được Sanger công bố năm 1977 là một trong những kỹ thuật đầu tiên được áp dụng phổ biến. Ngày nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của máy giải trình tự tự động.
Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản sẽ được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G.
Các bước giải trình tự trên máy tự động:
- Bước 1: PCR đoạn gen cần giải trình tự và tinh sạch sản phẩm PCR.
- Bước 2: Thực hiện phản ứng chu trình giải trình tự trên máy tự động với một trong hai mồi xuôi (F) hoặc mồi ngược (R) và các thành phần cần thiết khác (dNTP, ddNTP gắn huỳnh quang,…).
- Bước 3: Tủa sản phẩm giải trình tự và loại bỏ chất đánh dấu thừa. - Bước 4: Điện di mao quản sản phẩm trên máy và đọc kết quả.
Hình 1.8. Giải trình tự gen bằng máy tự động (Nguồn: https://en.wikipedia.org)
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU