3.4.1. Kết quả nghiên cứu điều kiện chiết tách enzyme
Để thu được lượng dịch lên men đủ lớn cho các nghiên cứu tiếp theo khi enzyme được sinh tổng hợp ở lượng tối đa, động học quá trình lên men sinh tổng hợp acetyl esterase bởi A. pullulans được nghiên cứu trong quá trình nuôi cấy nấm trên môi trường lên men lỏng với cơ chất rơm, pH 7.
Dịch môi trường nuôi cấy nấm A. pullulans được ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút loại khuẩn ty nấm và cơ chất. Phần dịch được tủa với
Nguyễn Hà Bích Huyền 33 CNSH 12-02 dung môi phân cực là axeton, ethanol và muối vô cơ ammonium sulfate ở các nồng độ cuối khác nhau (40, 50, 55, 60, 65 và 70%; v/v). Quá trình tủa protein được tiến hành ở 4oC trong 12 giờ, sau đó ly tâm thu cặn protein. Các phân đoạn thu được sau ly tâm và bay hơi dung môi được hòa lại với đệm phosphate 10mM (pH 6,0) để xác định hàm lượng protein và hoạt lực enzyme.
Nhìn chung, kết quả thu được cho thấy nồng độ protein tổng và hoạt tính acetyl esterase ở các phân đoạn tủa bằng muối ammonium sulfate đều thấp, đối với các phân đoạn tủa bằng aceton thì nồng độ protein cao hơn nhưng hoạt tính enzyme không cao. Nồng độ protein cũng như hoạt lực acetyl esterase cao nhất được xác định ở phân đoạn tủa bằng ethanol với nồng độ dung môi 60% (v/v) và hoạt lực enzyme 125,1U mg-1 (Bảng 2).
Bên cạnh đó, phương pháp lọc 10 kDa cut-off ở 11oC cũng được nghiên cứu so sánh. Ở phương pháp này cho thấy lượng protein thu được tương đối thấp (do các protein có trọng lượng phân tử <10 kDa đã được loại bỏ; số liệu không thể hiện ở đây) nhưng hoạt tính enzyme còn lại cao hơn nhiều so với các phương pháp tủa ở trên. Theo đó nồng độ protein thu được là 0,7 mg ml-1 và hoạt tính riêng là 131,8 U mg-1. Đây là phương pháp cho hiệu quả thu hồi enzyme cao do ít ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme so với dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate.
Bảng 2: Kết quả cô, chiết tách protein enzyme từ dịch nuôi cấy nấm
Phương pháp Nồng độ (%; v/v) 40% 50% 55% 60% 65% 70% Tủa aceton 42,7 99,3 86,4 55,6 34,3 33,2 Hoạt tính riêng (U mg-1 protein) Tủa ethanol 66,2 116,7 121,2 125,1 106,1 82,7 Tủa sulfat-amon 61,7 84,4 82,1 94,7 55,2 34,3 Siêu lọc 10 kDa cut-off 131,8 U mg -1
Nguyễn Hà Bích Huyền 34 CNSH 12-02
3.4.2. Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel
Sơ đồ quy trình tinh sạch:
Dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau 3 tuần được cô đặc bằng siêu lọc (màng lọc 10 kDa cut-off). Sau đó protein enzyme biểu hiện hoạt tính acetyl esterase được tinh sạch bằng sắc ký lỏng. Bước đầu tiên được thực hiện trên cột trao đổi ion DEAE Sepharose ở pH 4,5 với đệm Natri acetate 50 mM. Kết quả sau khi lọc rửa đã thu được 2 phân đoạn hoạt tính enzyme acetyl esterase (ký hiệu phân đoạn I và II). Phân đoạn cao nhất hoạt tính với lượng 39 mg protein hoạt tính AE (22,2 U) được hòa lẫn và nạp tiếp lên cột SuperdexTM 75.
Bước tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel qua cột SuperdexTM 75 ở pH 6,5 với đệm Natri acetate 50 mM và nồng độ NaCl 100 mM, phân đoạn hoạt tính acetyl esterase (đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate). Các
Dịch chiết thô
Siêu lọc 10 kDa cut-off
Sắc ký trao đổi anion DEAE
Sắc ký lọc gel SuperdexTM 75
Nguyễn Hà Bích Huyền 35 CNSH 12-02 phân đoạn hoạt tính enzyme được trộn lẫn, cô đặc và thẩm tách qua màng lọc kích thước 10 kDa như trên với đệm Natri acetate 10 mM (pH 6,0) và bảo quản ở -20 oC. Sau quá trình tinh sạch thu được 10,4 mg protein enzyme tương đương 13,1 U acetyl esterase.
Sau bước sắc ký lọc gel này, duy nhất một phân đoạn hoạt tính enzyme acetyl esterase được thu (Hình 11), phân đoạn này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo về đặc tính protein enzyme cũng như nghiên cứu chuyển hóa in vitro bằng enzyme.
Bảng 3: Các bước tinh sạch protein enzyme có hoạt tính acetyl esterase Các bước tinh sạch Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính riêng (U/mg) Hiệu suất (%) Độ tinh sạch (lần) Dịch chiết thô 712,0 50,1 0,07 100 1 Siêu lọc 10kDa cut-off 416,1 43,5 0,10 86,8 1,5 DEAE Sepharose 39,2 22,2 0,56 44,3 8,1 Lọc gel SEC SuperdexTM75 10,4 13,1 1,25 26,1 17,9
Nguyễn Hà Bích Huyền 36 CNSH 12-02
Hinh 11: Tinh sạch acetyl esterase qua các bước sắc ký lỏng: (A) sắc ký trao
đổi anion DEAE Sepharose và (B) sắc ký lọc gel SuperdexTM 75; (─) độ hấp thụ ở λ=280nm và (●) hoạt tính ApoAE trên cơ chất p- nitrophenyl acetat
Nguyễn Hà Bích Huyền 37 CNSH 12-02
3.5. Đặc tính của acetyl esterase từ nấm A.pullulans
Điện di SDS-PAGE của phân đoạn I qua các bước tinh sạch ở trên cho thấy một vạch protein hoạt tính acetyl esterase sau khi nhuộm với Colloidal Blue Staining Kit với trọng lượng phân tử MW= 42,5 kDa (hình 12). Đặc tính hóa-lý của enzyme tương ứng với đặc tính của các acetyl esterase đã biết (34- 56 kDa; Kormelink et al., 1993; Basaran & Hang, 2000).
Hình 12: Protein tinh sạch biểu hiện hoạt tính acetyl esterasetrên điện di SDS-PAGE
Nguyễn Hà Bích Huyền 38 CNSH 12-02
3.6. Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme
Hình 13: Nhiệt độ và pH của enzyme acetyl esterase tinh sạch từ dịch nuôi
cấy nấm Aureobasidium pullulans var. namibiae ở các điều kiện nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau
Kết quả hình 13-A cho thấy, enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40oC, và thấp nhất ở 25 oC. Hoạt tính của enzyme chỉ đạt 21 U ml-1 khi phản ứng ở nhiệt độ 25oC và tăng dần khi nhiệt độ đạt 40 oC sau đó giảm hơn 50% hoạt tính khi tăng nhiệt độ lên 45oC.
Như vậy, enzyme acetyl esterase hoạt động mạnh nhất tại pH 6,5 (60 Uml-1) và thấp nhất tại pH 5,5 (37,5 Uml-1) (Hình 13-B).
Nguyễn Hà Bích Huyền 39 CNSH 12-02
KẾT LUẬN
Đã xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu sinh tổng hợp enzyme acetyl esterase của chủng nấm Aureobasidium pullulans var. namibiae
(ApoAE) như sau:
1. Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ chất là rơm, thời gian nuôi cấy 21 ngày, nhiệt độ 28oC, pH 7 trong điều kiện nuôi lắc 200 v/ph. Theo đó, hoạt tính enzyme acetyl esterase cao nhất đạt 1567,7 U/L.
2. Thành phần môi trường nuôi cấy nấm A. pullulans như sau: MgSO4 0,5 gL-1; KH2PO4 1,5 gL-1; pepton 3,0 gL-1; dịch vi lượng 0,01 L), pH=7, và bổ sung 2% (w/v) cơ chất rơm.
3. Protein enzyme có thể được tinh sạch sơ bộ từ dịch chiết bằng phương pháp siêu lọc 10 kDa cut-off ở 11oC. Protein enzyme biểu hiện hoạt tính acetyl esterase được tinh sạch qua 2 bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose và SuperdexTM 75. Protein enzyme biểu hiện hoạt tính acetyl esterase từ nấm A. pullulans có trọng lượng phân tử MW=42,5 kDa (xác định bằng điện di SDS-PAGE).
Nguyễn Hà Bích Huyền 40 CNSH 12-02
KIẾN NGHỊ
Để hoàn thiện hơn đề tài, có thể thực hiện các nghiên cứu tiếp theo: - Nghiên cứu xác định các thông số động học xúc tác của enzyme acetyl esterase từ nấm Audreobasidium pullulans var. namibiae ( Vmax, Km)
- Nghiên cứu khả năng xúc tác của enzyme acetyl esterase thủy phân liên kết acetyl của sinh khối giàu xylan (arabinoxylan, mùn gỗ…)
Nguyễn Hà Bích Huyền 41 CNSH 12-02
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hồ Sỹ Tráng, Cơ sở hóa học gỗ và cellulose, tập 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2006, p.8 - 17.
2. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân, Nguyễn Lân Dũng (1982), “Enzyme vi sinh vật tập II” Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật
3. Trịnh Tam Kiệt. 2011. Nấm lớn ở Việt Nam. Tập 1 (Tái bản lần thứ 2). 314 trang. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ
4. Christakopoulos, P., Mamma, D., Kekos, D., Macris, B. (1999) - Enhanced acetyl esterase production by Fusarium oxysporum. World J. Microbiol. Biotechnol. 15: 443-446.
5. Dashtban M, Schraft H & Qin W (2009) Fungal bioconversion of lignocellulosic residues: opportunities and perspectives. Int. J. Biol. Sci. 5:
578-595.
6. De Vries RP, Nadal M, van de Brink J, Vivas-Duarte DA & Stalbrand H (2011) Fungal degradation of plant oligo- and polysaccharides.
Carbohydrate modifying enzymes and microorganisms,(Grunwald P, ed.eds.), p.pp. 693-760. Pan Stanford publishing Pte. Ltd., Singapore
7. Do Huu Nghi, René Ullrich, Franco Moritz,Le Mai Huong, Vu Dinh Giap, Do Huu Chi, Martin Hofrichter, Christiane Liers (2015). The Ascomycete Xylaria polymorpha Produces an Acetyl Esterase That Solubilises Beech Wood Material to Release Water-soluble Lignin Fragments. J Korean Soci Appl Biol Chem,58:415-421.
8. Eriksson, K.E., Blanchette, R.A., Ander, P. 1990. Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components, 1st ed. Springer Verlag, New York, NY
Nguyễn Hà Bích Huyền 42 CNSH 12-02 9. Gírio FM, Fonseca C, Carvalheiro F, Duarte LC, Marques S & Bogel- Lukasik R (2010) Hemicelluloses for fuel ethanol: A review. Bioresour. Technol. 101: 4775-4800.
10. Hataka, A. 2001. Biodegradation of lignin, p. 129-180. In Hofrichter, M., Steinbüchel, A. (ed.), Biopolymers: Lignin, humic substances and coal, vol. 1. Wiley-VCH, Weinheim.
11. Joseleau J, Comtat J & Ruel K (1993) Chemical structure of xylans and their interaction in the plant cell walls. Xylans and Xylanases,(Visser J, Beldman G, Kusters-van Someren M & Voragen A, ed.eds.), p.pp. Elsevier Sci., The Netherlands
12. Liers, C., Ullrich, R., Steffen, K. T., Hatakka, A. and Hofrichter, M. (2006). Mineralization of 14C-labelled synthetic lignin and extracellular enzyme activities of the wood-colonizing ascomycetes Xylaria hypoxylon and Xylaria polymorpha. Appl. Microbiol. Biotechnol. 69, 573-579
13. Lilholt, H., Lawther, J.M., 2000. Natural organic fibres. Elsevier. In: Kelly, A. and Zweben, C. (Ed.), comprehensive composite materials, vol. 1, pp. 303-325. A Limayem, S.C Ricke
14. Linden, J., Samara, M., Decker, S. (1994) Purification and characterization of an acetyl esterase from Aspergillus niger. Biotechnol. Appl. Biochem. 45:383-393.
15. Naran, R., Black, S., Decker, S.R., Azali, P. (2009) Extraction and characterization of native heteroxylans from delignified corn stover and aspen. Cellulase 16:661-675.
16. Nghi, D.H., Bittner, B., Kellner, H., Jehmlich, N., Ullrich, R., Pecyna, M.J., Nousiainen, P., Sipilä, J., Huong, L.M., Hofrichter, M., Liers, C. (2012) The wood-rot ascomycete Xylaria polymorpha produces a novel GH78 glycoside hydrolase that exhibits α-L-rhamnosidase and feruloyl esterase activity and releases hydroxycinnamic acids from lignocelluloses. Appl. Environ. Microbiol. 78:4893-4901
Nguyễn Hà Bích Huyền 43 CNSH 12-02 17. Ohta, K., Moriyama, S., Tanaka, H., Shige, T., Akimoto, H. (2001) Purification and characterization of an acidophilic xylanase from Aureobasidium pullulans var. melanigenum and sequence analysis of the encoding gene. J. Biosci. Bioengin. 92: 262-270
18. Pérez, J., Muñoz-Dorado, J, de la Rubia, T, Martínez, J. (2002) Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin. Microbiol. 5: 53 - 63.
19. Pouvreaua, L., Jonathana, M.C., Kabel, M.A., Hinzb, S.W.A., Gruppena, H., Scholsa, H.A. (2011) Characterization and mode of action of two acetyl xylan esterases from Chrysosporium lucknowense active towards acetylated xylans
20. Rich, J.O., Leathers, T.D., Anderson, A.M., Bischoff, K.M., Manitchotpisit, P. (2013) Laccases from Aureobasidium pullulans. Enzym. Microb. Technol. 53: 33-37;
21. Singh, R.S., Saini, G.K., Kennedy, J.F. (2008) Pullulan: Microbial sources, production and applications. Carbohydr. Polym. 73: 515-531
22. Sundberg M, Poutanen K (1991). "Purification and properties of two acetylxylan esterases of Trichoderma reesei".Biotechnol. Appl. Biochem. 23. Time, T. E. 1967, Recent progress in the chemistry of wood hemicelluloses, Wood Sci. Technol. 1, p 45-70.
24. Tsujiyama S, Nakano N (1996). Distribution of acetyl esterase in wood-rotting fungi. Mycoscience 37:289–294
25. Wang, C-L., Li, L., Xin, F-H., Liu, Y-Y., Chi, Z-M. (2014) Evaluation of single cell oil from Aureobasidium pullulans var. melanogenum P10 isolated from mangrove ecosystems for biodiesel production. Proc. Biochem. 49: 725-731
26. Zhang, Y.H., Ding, S.Y., Mielenz, J.R., Cui, J.B., Elander, R.T., Laser, M., Himmel, M.E., McMillan, J.R., Lynd, L.R. (2007) Fractionating
Nguyễn Hà Bích Huyền 44 CNSH 12-02 recalcitrant lignocellulose at modest reaction conditions. Biotechnol. Bioeng. 97:214-223
27. Zalar, P., Gostinčar, C., de Hoog, G.S., Uršič, V., Sudhadham, M., Gunde-Cimerman, N. (2008). Redefinition of Aureobasidium pullulans and its varieties. Stud. Mycol. 61:21-38
28. Peters, D. (2007) Raw materials. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 105:1-30
29. http://www.moldlibrary.ca 30. http://www.corbisimages.com
31. http://tailieu.vn/tag/te-bao-cellulose.html Formatted: Font: 14 pt, Underline, Font color:
Nguyễn Hà Bích Huyền 45 CNSH 12-02
PHỤ LỤC
Sự phát triển của nấm Aureobasidium pullulans var namibiae trên đĩa thạch (A) và trên môi trường lên men lỏng (B) sau 12 ngày nuôi cấy ở 28oC
Nguyễn Hà Bích Huyền 46 CNSH 12-02